Preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias

Introducción Las mitocondrias de corazón de rata es una de las preparaciones más comunes de los estudios anteriores y actuales del metabolismo celular. Se pueden obtener de forma rápida y fiable en gran cantidad de tipo silvestre o animales knock-out. El procedimiento general consiste en la digestión del tejido por la tripsina, fraccionamiento y centrifugación diferencial. Hay varias condiciones que han de mantenerse durante el aislamiento de las mitocondrias de varios tejidos, incluyendo el corazón (Fig. 1). El tejido tiene que ser bien picada, ya que afecta directamente el rendimiento de las mitocondrias obtenidas. El tejido del corazón que es mejor para picar con pequeñas tijeras curvas y puede ser seguido por el uso de un triturador de tejidos Latapie, o si un triturador de tejidos no está disponible, una prensa de ajo con una salida de diámetro de los agujeros de alrededor de 1,0 mm de diámetro. Es necesario para mantener la temperatura de las soluciones a cada paso. Por lo tanto, todo el procedimiento ha de llevarse a cabo en una habitación fría y todos los instrumentos y las soluciones tienen que estar preparados y refrigerados con antelación. Si las condiciones de temperatura no se mantienen estables varias propiedades de la preparación se puede perder. La estructura mitocondrial es muy sensible a las heladas por lo overfreezing de la suspensión (por ejemplo durante la centrifugación) no está permitido, especialmente si los estudios de transporte activo son muy importantes. Un parámetro importante es el tiempo de duración del procedimiento, el aislamiento debe ser realizado lo más rápidamente posible y la preparación obtenida debe ser utilizado inmediatamente. Por lo tanto, instrumentos quirúrgicos, soluciones y aparatos tienen que estar preparados de antemano. Materiales e instrumentos Instrumentos Tijeras rectas de operación, el punto fuerte Tijeras curvas Fórceps Una caja de petri Pequeño embudo + pedazo de nylon filtro (previamente lavada) 6 vasos de 50 ml Dos agitadores magnéticos y dos baños de hielo Un gran baño de hielo Dos barras magnéticas pequeñas Espátulas para raspar pellet Tubos de centrífuga Prensa Latapie tejido (se puede sustituir con prensa de ajo) Teflón-vidrio de 20 ml y homogeneizadores de un 2 ml- Residuos vaso Tubos Eppendorf de suspensión definitiva mitocondrial y muestras para la determinación de proteínas Baños de hielo Soluciones (calculado por 2 ratas): Tampón de lavado: 0,3 M de sacarosa, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) Aislamiento de amortiguación: 0,3 M de sacarosa, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (preparado a partir de la solución de lavado 100 ml). Albúmina sérica bovina puede ser sustituidos por otros menos caros de ácidos grasos libres análogos. El mismo tampón, o sus variantes isotónicas se puede utilizar como buffer de resuspensión. Tripsina (Sigma T8003): Se 2.5mg/ml en 1 mM HCl (0,5 ml) Inhibidor de tripsina de soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de solución tampón de aislamiento Protocolo El esquema general del procedimiento se muestra en la figura. 1. Corazones deben ser enfriados y lavados en tampón de lavado, el tejido extirpado ventricular, picada y homogeneizada durante el tratamiento con tripsina fotolítica. La suspensión se centrifuga a baja velocidad y el sobrenadante obtenido se centrifugó de nuevo a una velocidad más alta para recoger las mitocondrias. En función de los experimentos previstos el buffer resuspensión puede ser sustituida por cualquier otra solución isotónica. Los animales fueron terminados de acuerdo con el Reino Unido "Animals (Scientific Procedures) Act". por dislocación cervical seguido por decapitación. Es necesario extraer el corazón inmediatamente después de la decapitación del animal, de modo que no hay retraso entre la terminación de los animales y la extracción de corazón. Si el aislamiento paralelo de mitocondrias de hígado se espera que las ratas deben estar en ayunas durante la noche antes del experimento. Preparar tres vasos de precipitado que contiene 40 ml de Tampón de Lavado. Enfriar en un baño de hielo y sal de 3 a 5 min antes de proceder al siguiente paso. Asegúrese de que no los overfreeze y utilizar inmediatamente justo después de las nubes de cristales de hielo comienzan a aparecer. Abrir el tórax de la rata decapitado y extraer el corazón. Hacen pequeñas incisiones y luego transferir inmediatamente el corazón a la solución enfriada con hielo en el vaso de primera. Apriete el corazón para eliminar la sangre y la puso en el segundo vaso. Repita esta operación para cada corazón. Seca el corazón en el papel de filtro. Eliminar todas las grasas en la sangre, coagulada, aurículas y la fascia y la piscina del tejido ventricular. Picar el tejido combinado con pequeñas tijeras curvas en la placa de Petri en el hielo durante unos 5 minutos hasta que el tamaño de las partículas es de unos 1-2 mm. Coloque el tejido picado en la prensa del tejido y pasartravés de él. Tenga en cuenta que una cantidad sustancial de material puede permanecer en la prensa para recoger todos los tejidos del corazón de las paredes y el fondo de la prensa. Transferir el material en el vaso con 50 ml de Tampón de Lavado y revuelva. Después se filtra la suspensión a través de un filtro de nylon. Lave el tejido picado en el filtro 3 veces con el tampón de lavado y descartar el filtrado. La transferencia de los tejidos lavados en 20 ml de tampón de lavado y colocarlo en el baño de hielo en el agitador magnético. Añadir 0,5 ml de solución de tripsina con agitación constante y en marcha el temporizador. Se prepara otro agitador magnético, baño de hielo y un segundo vaso de 50 ml. En el minuto 4 brevemente homogeneizar la parte de suspensión por parte de utilizar una pequeña muy ajustada de vidrio Teflón homogeneizador (10 y 15 ml) con varios golpes arriba y abajo para dispersar a la suspensión. Después de la homogeneización de transferencia de la suspensión en el segundo vaso. Repita el procedimiento en el minuto 9 º, por lo que se realiza la homogeneización de la suspensión de dos veces en total. Después de 15 minutos de incubación, agregar 10 ml de aislamiento de un tampón que contiene inhibidores de la tripsina y se incuba durante 1 min. Filtrar la suspensión una vez más a través de un filtro de nylon y guardar el líquido filtrado. Recoger la fracción de partículas a la izquierda en un filtro y se homogeneiza durante 1 minuto en 15-20 ml de tampón de lavado. Combine el homogeneizado con el filtrado y centrifugado durante 15 minutos a 600g. Cuidadosamente filtra el sobrenadante resultante en un tubo de centrífuga de nuevo. Evitar la contaminación por el sedimento y se centrifuga de nuevo durante 15 min a 8500g. Después de la centrifugación de alta velocidad descartar el sobrenadante y lavar el pellet 2-3 veces con 1 ml de buffer de descartar la mullida capa blanca del borde exterior. Romper la pastilla con la espátula, sino evitar la mancha roja de los eritrocitos en la parte inferior. Si las células sanguíneas se loos, eliminar los bits de color rojo de la suspensión antes de la homogeneización. Resuspender el precipitado con un homogeneizador de pequeñas o bien mediante pipeteo suave. Diluir la suspensión con más Isolationbuffer y centrifugar de nuevo durante 15 min a 8500g. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en la resuspensión de búfer (un tampón isotónico de elección) y se centrifuga de nuevo. El marrón resultante pastilla contiene lavado mitocondrias intactas. Resuspender el precipitado en un volumen muy pequeño de tampón isotónico de su elección. Figura 1. Esquema que demuestra el procedimiento paso a paso de aislamiento de las mitocondrias de corazón de rata. Parte superior, Etapas 1-9: alteración del tejido, el tratamiento de la tripsina y la homogeneización; parte inferior, las etapas 10-15: centrifugación diferencial.