Préparation de coeur de rat fortement couplées Mitochondries

Présentation Les mitochondries du coeur de rat est l'une des préparations les plus courantes pour les études passées et actuelles du métabolisme cellulaire. Ils peuvent être obtenus rapidement et sûrement en grande quantité à partir de type sauvage ou animaux knock-out. La procédure générale se compose de la digestion des tissus par la trypsine, de fractionnement et de centrifugation différentielle. Il ya plusieurs conditions qui doivent être conservés pendant l'isolement des mitochondries de divers tissus, y compris le cœur (fig. 1). Le tissu doit être soigneusement haché, car elle affecte directement le rendement des mitochondries obtenues. Tissu cardiaque est préférable de mâche avec de petits ciseaux courbes et peut être suivie par utiliser un broyeur de tissus Latapie, ou, si un broyeur de tissus ne sont pas disponibles, un presse-ail avec sortie trous d'un diamètre d'environ 1,0 mm de diamètre. Il est nécessaire de maintenir la température des solutions à chaque étape. Donc toute la procédure doit être effectuée dans une chambre froide et tous les instruments et les solutions doivent être préparées et refroidies à l'avance. Si les conditions de température ne sont pas restés stables plusieurs propriétés de la préparation peut être perdu. La structure mitochondriale est très sensible à la congélation de sorte overfreezing de la suspension (par exemple lors de la centrifugation) n'est pas permise, surtout si les études de transport actif sont importants. Un paramètre important est le temps-durée de la procédure; l'isolement doit être effectuée aussi rapidement que possible et de la préparation obtenue doit être utilisée immédiatement. Par conséquent, des instruments chirurgicaux, des solutions et des appareils doivent être préparés à l'avance. Matériel et instruments Instruments Droit Ciseaux d'exploitation, point pointu Ciseaux courbes Forceps Boîte de Petri Petit entonnoir + morceau de filtre en nylon (prélavés) 6 béchers de 50 ml Deux agitateurs magnétiques et deux bains de glace Un grand bain de glace 2 petites barres magnétiques Spatules à granulés gratter Tubes à centrifuger Appuyer sur le tissu Latapie (peut être remplacé par presse-ail) Téflon-verre homogénéisateurs 20ml et 1-2ml Bécher déchets Des tubes Eppendorf de suspension mitochondriale finale et des échantillons pour le dosage des protéines Bains de glace Solutions (calculé par 2 rats): Tampon de lavage: 0,3 M de saccharose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM d'EDTA (1000 ml) Tampons Isolement: 0,3 M de saccharose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (100ml préparés à partir de la mémoire tampon de lavage). L'albumine sérique bovine peut être remplacé par moins chère d'acides gras libres analogues. Le même tampon isotonique ou de ses variations peut être utilisé comme remise en suspension de mémoire tampon. La trypsine (Sigma T8003) solution: 2.5mg/ml de 1mM HCl (0,5 mL) Inhibiteur de la trypsine du soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de tampon d'isolement Protocole Le régime général de la procédure est indiquée sur la Fig. 1. Coeurs doivent être refroidis et lavés dans laver tissu ventriculaire tampon, excisée, hachée et homogénéisée pendant le traitement à la trypsine photolytique. La suspension est centrifugée à basse vitesse et le surnageant obtenu est centrifugé à nouveau à vitesse plus élevée pour recueillir les mitochondries. Selon les expériences prévues le tampon resuspendant peut être remplacé par n'importe quelle autre solution isotonique. Les animaux ont été résilié en conformité avec le Royaume-Uni "Animals (Scientific Procedures) Act." par dislocation cervicale suivie par décapitation. Il est nécessaire d'extraire le cœur immédiatement après la décapitation de l'animal, afin qu'il n'y ait aucun délai entre la cessation des animaux et de l'extraction du coeur. Si l'isolement parallèle des mitochondries de foie est attendu, les rats doivent être mis à jeun pendant une nuit avant l'expérience. Préparer trois béchers contenant 40 ml de tampon de lavage. Les refroidir dans le bain de glace-sel pendant 3 à 5 min avant de passer à l'étape suivante. Assurez-vous de ne pas les overfreeze et utiliser immédiatement, juste après les nuages ​​de cristaux de glace commencent à apparaître. Ouvrez la cage thoracique du rat décapité et extraire le coeur. Faire de petites incisions et ensuite transférer immédiatement au cœur de la solution glacée dans le bécher d'abord. Presser le coeur d'enlever le sang et le mettre dans le second bécher. Répétez cette opération pour chaque cœur. Sécher le cœur sur le papier filtre. Retirez toute la graisse, du sang coagulé, oreillettes et des fascias et la piscine du tissu ventriculaire. Emincez les tissus mis en commun avec les petits ciseaux courbes sur le plat de Pétri sur la glace pendant environ 5 min jusqu'à ce que la taille des particules est d'environ 1-2 mm. Mettez le tissu hachée dans la presse du tissu et de passerc'est à travers. Soyez conscient qu'une quantité substantielle de la matière peut demeurer dans la presse afin de recueillir tous les tissus du cœur de la parois et le fond de la presse. Transférer le matériel dans le bécher avec 50 ml tampon de lavage et remuer. Puis filtrer la suspension à travers un filtre en nylon. Laver les tissus hachés sur le filtre 3 fois avec le tampon de lavage et jeter le filtrat. Transfert le tissu lavé dans 20 ml de tampon de lavage et de le placer dans le bain de glace sur l'agitateur magnétique. Ajouter 0,5 ml de solution de trypsine sous agitation constante et lancer le chronomètre. Préparer un autre agitateur magnétique, bain de glace et un second 50 bécher. Sur le 4 ème minute brièvement homogénéiser la portion par portion de suspension à l'aide d'un petit vaguement équipée de verre téflon homogénéisateur (10-15ml) avec plusieurs coups de haut en bas pour disperser la suspension. Après homogénéisation de transfert de la suspension dans le second bécher. Répétez la procédure sur la 9 ème minute, de sorte que vous effectuez l'homogénéisation de la suspension de deux fois au total. Après 15 min d'incubation, ajouter 10 ml d'isoler inhibiteur de la trypsine tampon contenant et incuber pendant 1 min. Filtrer la suspension à nouveau à travers un filtre en nylon et enregistrez le filtrat. Recueillir la fraction de particules à gauche sur un filtre et homogénéiser pendant 1 min dans 15-20 ml de tampon de lavage. Combinez l'homogénat avec le filtrat et centrifuger pendant 15 min à 600g. Soigneusement filtrer le surnageant résultant dans un tube de centrifugeuse de nouvelles. Eviter la contamination par le culot et centrifuger à nouveau pendant 15 min à 8500G. Après centrifugation à grande vitesse jeter le surnageant et rincer les 2-3 granulés fois avec 1 ml de tampon de l'abandon de la couche blanche duveteuse bord extérieur. Brisez le culot avec la spatule, mais éviter la tache rouge des érythrocytes dans le fond. Si les cellules du sang obtenu Loos, retirez les morceaux rouges de la suspension avant homogénéisation. Reprendre le culot avec un homogénéisateur petites ou alternativement par pipetage doux. Diluer la suspension avec plus Isolationbuffer et centrifuger à nouveau pendant 15 min à 8500G. Jeter le surnageant, resuspendre le culot dans du tampon remise en suspension (un tampon isotonique de choix) et centrifuger à nouveau. Le brun résultant culot contient lavés mitochondries intactes. Reprendre le culot dans un très petit volume de tampon isotonique de votre choix. Figure 1. Schéma montrant la procédure étape par étape d'isolement des mitochondries de coeur de rat. Partie supérieure, Étapes 1-9: désorganisation tissulaire, traitement à la trypsine et l'homogénéisation; partie inférieure, les stades 10-15: centrifugation différentielle.