Strategieën voor de Studie van de neuronen van Cold-preconditionering

Steriel en aseptische technieken zijn cruciaal voor de voorbereiding, het onderhoud en het gebruik van slice culturen voor langere perioden. Bovendien is de reden voor ons gebruik van slice culturen pas na 18 dagen in vitro gebaseerd op bewijsmateriaal dat aangeeft prikkelende en remmende synaptische transmissie wordt het meest volwassen, en glia (astrocyten en microglia) worden rustig en in overeenstemming met hun tegenhangers in vivo (zie figuur 1 ). 1. Voorbereiding & Onderhoud van de hippocampus Slice Culturen Op dezelfde dag van het kweken, evenwicht steriel inserts in 1,1 ml groei media die bestaat uit 50 ml basismedium Eagle, 25 Balanced Salt mL Earle's oplossing, 23 mL Horse Serum, 0,5 ml Glutamax (200 mM voorraad), 0,1 ml gentamicine (10 mg / mL voorraad), 0,4 ml fungizone (250 ug / ml), 1,45 ml D-glucose (45%; 42 mm in totaal). Houden zes-well trays in een incubator bij 36 ° C, 5% kooldioxide en 95% luchtvochtigheid. Voor maximale steriliteit, is ideaal kweken gebeurt in een HEPA-filter positieve druk cultuur kamer met de lucht ook gezuiverd via een self-contained ultra-violet light-air-reiniging fans, en tijdens het dragen van een schone laboratoriumjas en steriele handschoenen gestrekt boven het lab jas mouwen . Bereid slice culturen in een BSL-1 laminaire zuurkast dat alle benodigde materialen (dat wil zeggen, McIlwain weefsel chopper, gerelateerd Teflon inserts, scheermes snijmes, dissectie koud (3-4 ° C) plaat, chirurgische instrumenten, en dissectie petrischalen) omvat met behulp van een Wild (M8) stereomicroscoop. Laat de koelplaat (uitgevoerd vanaf een nabijgelegen water bad) tot 3-4 ° C temperatuur bereikt gedurende tenminste 30 minuten, terwijl op hetzelfde moment bloot dissectie materialen aan ultraviolet licht om verder te vestigen steriliteit van de dissectie gebied en tools. De laminaire stroming kap wordt periodiek getest om te garanderen het ultraviolette licht heeft voldoende kracht op het tafelblad niveau met een korte golf ultraviolet licht te meten meter. Gebruik rat pups (P8-P9 en ~ 23 g / ea. Nesten van afgemaakt tot 10 bij de geboorte) verdoofd met 100% kooldioxide in een klein dier doos op een aseptische bankje achter de zuurkast en gereinigd door dompelen in 100% ethanol in de zuurkast, waar alle volgende stappen worden uitgevoerd. Onthoofden pups in de ene helft van een 100 mm petrischaal en plaats de kop in de tweede helft, met behulp van een verse maaltijd per pup. Ontleden van de hersenen en plaats deze in de onderste helft van een 60 mm petrischaal met 10 ml steriele koud (3-4 ° C) Balanced Salt Solution Gey's aangevuld met D-glucose tot 6,5 mg / ml (dwz 7,5 ml van 45 % d-glucose per 500 ml fles van Gey's. Ontleden van de hippocampus van elk halfrond en leg ze op een Teflon schijf voor de McIlwain chopper. Spread media uit de buurt van het hersenweefsel met behulp van een iris spatel te snijden hersenen secties verhinderen zich te houden aan het mes. Gedeelte van de hippocampus loodrecht op de lengte-as met behulp van de McIlwain helikopter, met sectie dikte ingesteld op 350 tot 400 micrometer. Flink wassen vers gesneden plakjes off van de Teflon inserts en in de bovenste helft van een 60 mm petrischaal met koud (3-4 ° C) Balanced Salt Gey's oplossing met 6,5 mg / ml D-glucose met behulp van een een mL pipet. Inspecteer plakjes worden onder de stereomicroscoop voor een intacte dentate gyrus en de piramidale cellaag. Plaats voorzichtig de grootste plakken op een insert (drie per voegen en 12 plakken / pup) en te onderhouden onder normale incubatie omstandigheden in een incubator gereinigd om de zes maanden en gekalibreerd om de drie maanden met een infrarood-analyse van kooldioxide en thermometer, nauwkeurig tot op een decimaal. Vernieuwen groei van media in de cultuur gerechten elke 3-4 dagen in vitro met behulp van een BSL-2 kap en steriele techniek. Na 7 dagen in vitro, vervangen door media met 1,1 ml serum-vrij medium (SFM) bestaande uit 97 mL Neurobasal, 2 ml B27, 0,5 ml Glutamax (200 mm), 0,1 ml ascorbinezuur (0,5 M) en 0,68 ml D- Glucose (45%; 42 mm in totaal). 2. Pre-screen Vitaliteit van Slice Culturen Aliquot Sytox Green voorraad (10 pi) en bewaar bij -20 ° C. Verdun Sytox voorraad aan 500 nM werken concentratie in serum-vrij groei media (dat wil zeggen, 10 pi in 100 ml media). Bewaar Sytox media bij 4 ° C en gebruik tot maximaal een week. Plaats 1,1 ml Sytox per putje in 6-well cultuur gerechten en warm tot 36 ° C bij 5% koolstofdioxide voor een voldoende lange periode (dat wil zeggen, zoals blijkt uit het ontbreken van condens op de cultuur gerechten). Ondertussen laat een UV-lamp (dat wil zeggen, een TL-lichtbron met een FITC filter) gevoed via een gestabiliseerde voeding om een ​​uniforme lichtintensiteit ervoor te zorgen dat de temperatuur warm voor ten minste 20 minuten. Plaats slice culturen (18 dagens in vitro) in Sytox-media voor 10 min en dan weer terug naar SFM voor het screenen op onomkeerbare CA1 pyramidale laag letsel. Bekijk culturen op een aseptische oppervlakte van een omgekeerde microscoop onderzocht in het kader 5x vergroting. Accepteer culturen met minder dan 30 Sytox positieve cellen in het CA1 gebied. 3. Cold-Voorconditionering Plaats 1,1 ml SFM in 6-well cultuur gerechten. Laat gekoelde media (bijvoorbeeld 30 ° C) om evenwicht in een incubator (5% kooldioxide en 95% luchtvochtigheid) gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik. Afwezigheid van condens op de cultuur gerechten geeft aan dat er voldoende tijd voor het evenwicht zich heeft voorgedaan. Overdracht slice cultuur inzetstukken aan gekoelde media (1,1 ml / putje) tray bewaard bij 30 ° C en incubeer gedurende 90 min met behulp van steriele techniek in een BSL-2 zuurkast. Terug te plaatsen slice culturen in normale SFM onder normale omstandigheden incubatie gedurende 24 uur, weer met behulp van steriele techniek via een BSL-2 zuurkast. 4. Excitotoxische Letsel Begin slice cultuur experimenteel gebruik prescreent door het blootstellen aan Sytox media voor 20 minuten. Acquire individuele plak beelden met plakjes gehandhaafd op ongeveer dezelfde richting als die voor prescreent (achtergrond beelden). Dit wordt gedaan door het plaatsen van een teken naar links en twee merken aan de rechterkant met een viltstift op "10" en "twee" uur op elke insert. Deze manoeuvre maakt gebruik van dezelfde gebied van belang vorm voor elke cultuur set van beelden. Op hetzelfde moment, zet de UV-lamp bron (onder gereguleerde voeding), en de CCD camera voor een minimum van 20 minuten, zodat ze warm op temperatuur. Dan, kalibreren van de CCD-camera met een fluoroscein standaard. "Clear" de CCD door het blootstellen aan licht 50 cycli, tenzij een automatische kalibratie van CCD-camera wordt gebruikt. We hebben een programma binnen Metamorph aan onze Cool Snap camera gebruikt worden voor letsel kwantificering duidelijk. Plaats 10 pi van fluoroscein in 90 ml PBS (10 mM fosfaatbuffer, 150 mM NaCl op 7,3 pH) en vortex. Pipetteer 10 ul van fluoroscein mengsel op een 100 micrometer diep hemacytometer. Pas de volledige afbeelding intensiteit aan 1000/4096. Verzamel achtergrond beelden van slice culturen om te controleren of koude-conditionering geen letsel kunnen veroorzaken (dat wil zeggen, gooi culturen met ≥ 250 CA1 gebied van belang intensiteit). Bereid trays met NMDA media. Bereid 10 mM voorraad oplossing van NMDA ten minste wekelijks. Voor beschadiging door exitotoxinen, verdunnen NMDA tot 20 50 uM in SFM en evenwicht naar de normale incubatie omstandigheden gedurende tenminste 20 minuten. Met behulp van de BSL-2 kap en steriele techniek, plaats voegt in het NMDA-media gedurende 60 minuten onder normale incubatie omstandigheden. Spoel NMDA off van inserts door onderdompelen elke insert drie keer in drie aparte 60 mm gerechten die elk 10 ml Neurobasal opgewarmd tot 36 ° C. Gebruik niet meer dan drie inzetstukken voor elke set van drie 60 mm wassen gerechten. Keer terug naar de normale culturen incubatie omstandigheden. Verzamel letsel beelden 24 uur na blootstelling aan NMDA. Kalibreren camera met fluoroscein standaard zoals hierboven beschreven. Plaats culturen in Sytox media voor 20 minuten. Kwantificeren letsels: Met behulp van Metamorph software, trekken een AOI rond CA1 regio. Meten de intensiteit van geselecteerde regio voor "schade". Kopieer en plak AOI van de "schade" tot "achtergrond" beeld. Voer waarden van de "schade" en "achtergrond" in Excel. Kwantificeren "teller-achtergrond" voor Control en Cold-gepreconditioneerde culturen. Met behulp van statistische software (bijv. SigmaStat), lopen passende statistische tests om letsel van de experimentele groep (en) versus een controle groep, die altijd moet worden opgenomen bij elke experimentele run vergelijken. Opmerking: Als het letsel niveaus zijn laag in een dag na het letsel beelden, carry-out experiment met twee maal drie dagen. Bescherming in culturen kan te wijten aan een gebrek aan gevoeligheid voor de schade (figuur 2) worden gemaskeerd. Opmerking: De kwestie van de "bescherming" voor ons aanleiding om te verhuizen naar het meten van letsel niveaus en niet ratio's voor alle vergelijkingen (figuur 3). 5. Co-behandelingen Applied met Cold-preconditionering Een belangrijk voordeel van slice culturen is dat milieu-voorwaardes nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Dit betekent dat de cytokine signalering van koud-conditionering kan worden gemeten, nagebootst, en gemoduleerd om de kritische knooppunt aspecten ontleden. Recombinant (bijv. agonist) eiwitten en neutraliseren (bijvoorbeeld antilichaam of oplosbare receptor) eiwitten kan worden gebruikt om na te bootsen en te moduleren, respectievelijk cytokine-signalering. In het algemeen worden deze eiwitten aangemaakt en opgeslagen als fracties bij -20 ° C voor gebruik binnen de zes maanden om voldoende bioactiviteit te garanderen. We beschrijven hier voorbeeldig gebruik van TNF-α signalering intrekking gebruik van oplosbare TNF-receptor 1 (sTNFR1). Reconstrueren sTNFR1 in 0,1% bovine serum albumine in PBS om een ​​voorraad van 50 ug / ml, aliquot in 20-50 uL bedragen, en bewaar bij -20 ° C. Voor gebruik, verdunnen sTNFR1 tot 200 ng / mL in slice culturen groeimedia opgewarmd tot 36 ° C en plaats slice culturen in sTNFR1-media voor de 20 minuten voorafgaand aan de koude-preconditionering. Opmerking: Om variantie te verminderen, is het het beste tot 200 ng / mL sTNFR1 verdunnen in een groot volume van de groei media (dat wil zeggen, 1:250 verdunning van 50 ug / ml sTNFR1 voorraad leverbaar in 10 ml van de groei media vereist 40 uL sTNFR1) vs toe te voegen sTNFR1 rechtstreeks aan elk putje in de schaal (4,4 pi per 1,1 ml media). Verdunnen sTNFR1 tot 200 ng / mL in de media en plaats 1,1 ml bij elke insert goed. Laat media om tot 30 equilibreren ° C gedurende ten minste 20 minuten voor het blootstellen van slice culturen aan koude-preconditionering voor 90 min zoals hierboven beschreven. Plaats slice culturen terug op 36 ° C met sTNFR1 aanwezig in de media. 24 uur later, bloot culturen om Sytox media voor 20 min zoals eerder beschreven en het verzamelen van achtergrond afbeeldingen naar dat koude-conditionering niet verwonden culturen te controleren. Kwantificeren gegevens zoals hierboven beschreven. Refresh media met componenten om de 3-4 dagen in vitro. 6. Onmiddellijke en Vertraagde excitotoxische Injury na koude-preconditionering Onmiddellijk letsel met koude-preconditionering. Uitvoeren van koud-voorbehandeling zoals hierboven beschreven. Na koude-conditionering, terug naar de normale culturen incubatie gedurende 20 minuten. Dan, bloot culturen 20-50 uM NMDA letsel voor een uur. Spoel culturen drie keer zoals hierboven beschreven en terug te keren naar de normale incubatie. Na 24 uur, te verwerven letsel foto's zoals hierboven beschreven. Vertraagde effecten van de koude-preconditionering. Uitvoeren van koud-voorbehandeling zoals hierboven beschreven. Expose culturen tot NMDA letsel 24 uur later, zoals hierboven beschreven. Blijven om letsel te beelden te verwerven voor tot drie dagen na de eerste koude-conditioneren om bescherming te controleren. 7. RNA isolatie De volgende gen-expressie procedures worden geschaald voor een slice cultuur. Transfer slice culturen van groei media en normale incubatie tot 3 ml RNAlater in 6-well cultuur gerechten om RNA te stabiliseren. Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal drie dagen Tot de verwerking, zoals hieronder beschreven. Voorzichtig de slice cultuur til de insert met een fijne tip penseel en plaats in een ml koud (4 ° C) PBS in een 1,5 ml (DNase, RNase, en DNA-vrij) microcentrifugebuis. Centrifuge monsters voor 30 seconden en verwijder de PBS supernatant. Bewaar monsters bij -80 ° C. RNA te isoleren uit slice culturen (~ 250 ng / ea.), Ontdooien samples op het ijs. Isoleer RNA met behulp van Qiagen MicroRNeasy kit via de volgende procedures die worden beschreven in meer detail en aangepast uit de RNeasy Micro Handbook (Qiagen). Plaats 350 pi Buffer RLT (met 10 pi β-mercapto-ethanol per ml) in elk microcentrifugebuis die een stukje cultuur. Homogeniseren monsters door vortexen voor 30 sec. Vermaal weefsel, indien nodig (dat wil zeggen, weefsel pellet nog zichtbaar) met behulp van een disposable stamper tot het volledig gehomogeniseerd in Buffer RLT. Plaats 350 pl van 70% ethanol in het lysaat mix en pipet te mengen. Overdracht homogenaat een spin kolom en plaats in een collectie buis (zowel spin kolom en verzamelbuis worden geleverd door Qiagen). Centrifugeer monster gedurende 15 sec bij max. snelheid. Behoud van de kolom. Was de spin-kolom door de toevoeging van 350 pi buffer RW1 plus centrifuge voor 15 sec bij max. snelheid. Gooi buffer. Vul 10 pi van DNase I voorraad in 70 ui Buffer RDD tot 80 pi totale volume opleveren. Pipet voorzichtig te mengen niet vortex. Bereid 80 pi van de verwaterde DNase voorraad per monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg 350 ul buffer RW1 te spinnen kolom en centrifugeer 15 sec monster. Gooi collectie buis. Met behulp van een nieuwe collectie buis, voeg 500 ul buffer RPE te proeven en centrifugeer gedurende 15 sec en gooi buffer. Plaats 500 pl van 80% ethanol op de steekproef en centrifugeer gedurende 2 minuten. Gooi de collectie buis. Droog de spin kolommen door centrifugeren gedurende 5 min bij max. snelheid met buis caps open, gooi verzameling buizen, en de overdracht draaien kolom aan een 1,5 mL collectie buis door de kit. Geïsoleerde RNA, plaats 14 pi RNase-vrij water verzamelen over het midden van de spin kolom membraan. Centrifuge voor een min en het verzamelen van de vloeistof. Voeg 2 ul van RNasin (verdund tot een U / ul in TE buffer) en bewaar bij -80 ° C. TE-buffer bestaat uit 10 mM Tris (tris [hydroxymethyl] aminomethaan), 1 mM EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout hydraat) op 8,0 pH. 8. RNA Kwantificering Noot: RNasin niet interfereert met de RiboGreen test. Verdunnen RiboGreen 1:200 in RNase-vrij TE-buffer als volgt. TE (ml): 1; Ribogreen (pi): 5; TE (ml): 4; Ribogreen (pi): 20; TE (ml): 6; Ribogreen (pi): 30. RNA normen zijn als volgt bereid. Gist tRNA wordt gebruikt als de RNA-standaard. tRNA is opgeslagen (-20 ° C) als 1 mg / ml in TE buffer. Verdun de 1 mg / ml bouillon 1:100 in TE-buffer, met behulp van (DNase, RNase, en DNA-vrij) 1,5 ml microcentrifugebuizen om een ​​1 ug / ml werkstandaard te produceren. Bereid de standaardcurve direct in een 96-well fluorescerende testplaat door het toevoegen van de TE-buffer verdunningsmiddel eerst, dan het toevoegen van de juiste hoeveelheid van de 1 ug / mL standaard in de TE-buffer al in de putjes zoals weergegeven in de tabel hiernaast. Maak duplo voor elke standaard als volgt. Vol. van de std. (Pi): 100; Vol. van TE (pi): 0; RNA in goed (ng): 100; Vol. van de std. (Pi): 80; Vol. van TE (pi): 20; RNA in goed (ng): 80; Vol. van de std. (Pi): 60; Vol. van TE (pi): 40; RNA in goed (ng): 60; Vol. van de std. (Pi): 40; Vol. van TE (pi): 60; RNA in goed (ng): 40; Vol. van de std. (Pi): 20; Vol. van TE (pi): 80; RNA in goed (ng): 20; Vol. van de std. (Pi): 0; Vol. van TE (pi): 0; RNA in goed (ng): 0. De test wordt als volgt bereid. Voeg 99 ul van TE-buffer aan elk van de steekproef putjes van de 96 wells plaat. De meest efficiënte manier om dit te doen is het gebruik van een multichannel pipet. Voeg 1 ui van RNA aan de experimentele sample putten. Voeg 100 ul van de verdunde RiboGreen in elk putje met behulp van de multichannel pipet en vermaal met een of twee slagen van de pipet. Lees de plaat op een fluorescerende plaat reader bij 480 nm excitatie en 520 nm emissie. De bouw van een standaard curve met behulp van Microsoft Excel met de gemeten fluorescentie-intensiteit van RNA standaarden. Bereken RNA-concentraties in monsters met behulp van de resulterende lineaire vergelijking van de normen curve. 9. SYBR Green kwantitatieve PCR PCR-procedures zijn best gedaan in een schone ruimte speciaal gereserveerd voor het werken met RNA (figuur 4). Maak de omgeving en de bijbehorende laboratorium apparatuur tegen mogelijke DNA-verontreiniging en RNase activiteit voor gebruik met ultraviolet licht, 10% bleekmiddel of RNase Away. Draag handschoenen in alle procedures. Gebruik RNase vrij water voor alle procedures zoals die bij de kit. Gebruik geen DEPC-(diethylpyrocarbonate) behandeld water. Sluit alle PCR-gerelateerde buisjes onmiddellijk na gebruik te vertragen aërosol verontreiniging van vreemd DNA. Ontwikkelen en karakteriseren primers voor de mRNA doel (en) van belang. Deze methoden zijn beschreven in de aanvullende methoden om et al. Hulse., Journal of Neuroscience, 2008 13. cDNA wordt geproduceerd 30 tot 200 ng totaal RNA via reverse transcriptie met behulp van iScript. De keuze van het starten van RNA hoeveelheid wordt bepaald door de totale hoeveelheid RNA beschikbaar zijn met als doel het uitvoeren van RT-PCR analyse op een deel van het monster (dat wil zeggen, 10% -20% van het totaal). Het resterende groter deel van het RNA is opgeslagen voor toekomstige analyse. De iScript kit maakt gebruik van een combinatie van willekeurige hexameren en oligo-dT primers, en een aangepaste MMLV reverse transcriptase in een totaal volume van 20 pi. Reverse transcriptie opbrengst voor 25 ° C gedurende 30 minuten gevolgd door 42 ° C gedurende 50 min, en de reverse transcriptase wordt vervolgens gedenatureerd bij 85 ° C gedurende 5 minuten. Verdunnen cDNA in TE-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 ng / ul ten opzichte van het starten RNA hoeveelheid. SYBR Green PCR-gebaseerde strategie wordt gebruikt voor het versterken cDNA. PCR-reacties worden gecontroleerd in real-time door het bewaken van SYBR Green oprichting. De 50 pi reacties bevatten 3 mM MgCl2, 200 uM dNTPs, 15 pmol elk van de forward en reverse primers, 1 uM fluoresceïne, 1x SYBR groene kleurstof, 10 pi (4 ng) slice cultuur cDNA, en 1,25 U Platinum Taq polymerase in reactie buffer bestaande uit 50 mM KCl en 10 mM Tris, pH 8,3. PCR is uitgevoerd met behulp van de ICycler thermocycler dat kan gegevens verzamelen in real time. Fietsen parameters bestaan ​​uit 15 sec denaturatie (95 ° C), gevolgd door 30 sec annealing / uitbreiding (60 ° C) 45 keer herhaald. Optische metingen worden genomen tijdens het annealing / uitbreiding stap en Ct-waarden werden bepaald met behulp van de ICycler-systeem-software. cDNA voor cytokine doelen van belang en β-actine worden gebruikt om de standaard curves te construeren. Aantal kopieën wordt bepaald door het molecuulgewicht en de massa van het plasmide cDNA. Standaard curven van copy number / massa zijn gebouwd en in elke test. Ct-waarden voor elke cDNA verdunning worden gebruikt om het aantal kopieën v. Ct curve te bepalen. Cytokine en β-actine kopie-aantal niveaus worden bepaald voor monsters met behulp van standaard-bochten. 10. Kwantitatieve PCR voor Microarrays Kwantitatieve real-time qPCR reeks screening is een zeer gevoelig en reproduceerbaar middelen om probe voor low-level ontstekingsmediatoren expressie veranderingen. De RT2 Profiler PCR-array van SABiosciences wordt gebruikt voor ontstekingsmediatoren genexpressie verandert, met de volgende stappen in meer detail beschreven door de fabrikant. De test maakt gebruik van 0.1-1.0 ug RNA. We maken gebruik van lokale slice gebieden (bv. CA1 die ~ 250 ng totaal RNA biedt uit twee samengevoegde monsters) of een hele enkele plakjes, dat een vergelijkbaar bedrag van totaal RNA bevatten. Monster en controle RNA's zijn reverse getranscribeerd in cDNA met behulp van een eerste onderdeel kit (bijv. # C-03). De resulterende cDNA wordt gemengd met SYBR Green-gebaseerde PCR-mix (# PA-011) en 25 pi aliquotted in elk van de 96 putjes van de PCR-array-plaat (het meten van 84 unieke experimentele genen en 16 housekeeping genen). Een matrix bord is voorbereid voor de experimentele monster en een tweede plaat is vervaardigd voor de beheersing. Opmerking: De SYBR Green master mix die door de fabrikant is thermal cycler-specifiek. Thermische cycli is gedaan met behulp van een ICycler met een 40 cyclus protocol bestaat uit een denaturatie stap van 15 sec bij 95 ° C, gevolgd door een uitbreiding stap van een min bij 60 ° C. Optische data is verzameld tijdens de verlenging stap. Thermische cycli wordt gevolgd door smelt curve analyse het scannen van de 55-95 ° C temperatuur in stappen van 0,5 ° C. De relatieve expressie van genen in behandelde en controle platen werd bepaald met behulp van de 2 – ΔΔCt methode met behulp van de meegeleverde Excel gebaseerde software en uitgedrukt als een-voudige toename of afname ten opzichte van controles. Genen met twee-voudige toename of afname in expressie komen in aanmerking voor verdere evaluatie. Genen geïdentificeerd van PCR-array screening (bijvoorbeeld met behulp van # Parn-011A voor koude-preconditionering) worden verder confirmed met behulp van qPCR. PCR-arrays bepalen welke genen worden gereguleerd in reactie op prikkels. In het voorbeeld van koude-conditionering, identificeerden we de IL-11 gen als positief geregeld in reactie op koude-preconditionering. De volgende stap in de analyse is om te bevestigen dat de nieuw geïdentificeerde gen is geregeld in de slice culturen het gebruik van de qPCR assay hierboven beschreven. 11. Multiplexed Microsphere flowcytometrische Proteoom Assay Expose slice culturen tot koude-voorbehandeling zoals hierboven beschreven. Oogst slice culturen voor totaal eiwit assay. Til snijdt de insert met een fijn-tip borstel en een plaats in de 1 ml koud (4 ° C) PBS. Centrifugebuizen en verwijder PBS af slice culturen. Plaats op droog ijs tot de oogst klaar is. Bewaar buizen bij -80 ° C. Homogeniseren slice cultuur monsters voor het uitvoeren van een totaal eiwit assay. Bereid cellysis buffer voor homogenisering. Naar aanleiding van de instructies van de fabrikant (Bio-Rad), voeg proteaseremmers tot 5 ml lysis buffer en zet ze apart op ijs. Plaats 100 ul van lysis buffer op de slice culturen en schud plakken door en neer te pipetteren vijf keer met een 100 ul pipettip opengesneden om 1 mm. Schud samples op plaat schudder bij 4 ° C gedurende 20 minuten. Centrifugeer monsters bij 13.000 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C. Overdracht supernatant naar een schone buis en zet apart op ijs. Voer totaal eiwit assay. Bereid BSA (bovine serum albumine) eiwit normen. Reconstitueren voorraad BSA met ultrapuur water volgens de instructies van de fabrikant. Bereid eiwit normen, variërend 0-1000 ug / ml, verdund in lysis buffer. Bereken het volume van het werken reagens dat nodig is volgens de kit instructies. Bijvoorbeeld, (acht normen + 18 onbekende monsters) x (twee herhalingen) x (200 pi werken reagens nodig per monster) = 10,4 ml van het totale volume van het werken reagens nodig is om te laden op een 96 goed microplaat (bijv. microsfeer flowcytometrische analyse , zie hieronder). Bij het mengen van Reagens A met Reagens B, sommige troebelheid kunnen optreden, maar zal binnenkort verdwijnen. Belasting 10 pi van standaarden en monsters op microplate. Belasting 0,2 ml van het werken reagens in putten. Bedek microplaat met afdichtband en schud op de plaat shaker voor 30 sec. Incubeer microplaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Cool microplaat op kamertemperatuur (ongeveer 10 min) voor het lezen op een bord lezer bij 595 nm golflengte. De bouw van een standaard curve met behulp van Microsoft Excel met de gemeten extinctie van BSA normen. Bereken eiwit concentraties in monsters met behulp van de resulterende lineaire vergelijking van de normen curve. Verdunnen alle monsters om de laagste concentratie gemeten met lysisbuffer en bewaar bij -80 ° C. Uitvoeren van single-plex en multiplex cytokine weefsel (of vloeistof) assays, zoals beschreven tot in detail in de referenties # 12 en 16. 12. Immunohistochemie Fix culturen gedurende 24 uur met PLP fixatief bestaande uit 10 mL 16% paraformaldehyde, 1,096 g lysine, 0,42 g natrium fosfaat, en 0,17 g natrium perjodaat, gevuld tot een totaal volume van 80 ml met ultrapuur water (fixatief is 6,2 pH). We vinden dat PLP fixatief is een zachte fixatief dat de detectie van low-level immunokleuring die anders niet evident met andere fixatieven mogelijk maakt. Culturen zijn vastgesteld voor 24 uur en vervolgens overgebracht met een fijne borstel om PBS met natriumazide (100 mg / L). Helderveld immunokleuring van drijvende hele slice culturen wordt bereikt als volgt met alle stappen gekoppeld aan schudden bij ~ 50 rpm. Was slice culturen in 3 mL PBS drie keer voor 10 minuten. Quench slice culturen in 0,3% H 2 O 2. Verdunnen 30% H 2 O 2 voorraad-oplossing in PBS. Was slice culturen in PBS drie keer 10 minuten per stuk. Block slice culturen gedurende een uur bij kamertemperatuur in het blokkeren van 3 ml oplossing in een zes-well plaat die bestaat uit 10 ml geit serum, 0,75 ml Triton X-100, en 89,25 mL PBS. Serum voor de blokkering oplossing moet komen van dezelfde soort, waarin het secundaire antilichaam werd verhoogd. Incubeer slice culturen 's nachts in het primair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing bij 4 ° C. Het maximale volume van de primaire antistof-oplossing voor kleine glazen pyrex schaal putten moet 0,3 ml hogere volumes hebben de neiging te lopen over de rand van de plaat. Zet de schaal in een vochtige gesloten container. We hebben geen betrekking op de schotel met een hechtende film sinds secties kunnen worden gesponnen op de bovenliggende film en verloor voor verdere opwerking. Pas schudden snelheid van de plaat shaker om gewoon hoog genoeg zijn om plakjes in het antilichaam oplossing circuleren. Verwijder de schijfjes van glas plaat en wassen in PBS drie keer voor 10 minuten per wasbeurt. Incubeer plakken in het secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende een uur onder schudden. Gebruik maken van kleine glazen Pyrex-gerechten tot 0,3 ml tweede antilichaam oplossing te laden. Was drie keer in PBS, 10 min. per wasbeurt. Visualiseer kleuring met 3'-diaminobenzidine (DAB). Los 30 mg DAB in 3 ml dimethyl sulfoxide. Filter DAB met behulp van twee # 1 filter papers en wassen met 54 ml PBS. Vlak voor het gebruik, voeg 20 ul van 30% H 2 O 2. Incubeer culturen in DAB-oplossing voor 5-7 minuten bij kamertemperatuur. Let op: DAB is een kankerverwekkende stof en moet afgevoerd worden. Gooi alle DAB-oplossingen in een gemarkeerde container opgeslagen in een zuurkast, en plaats alle gerechten in bleekwater oplossing voor DAB uit te schakelen. Alle DAB-oplossingen moeten uiteindelijk worden weggegooid via het Institutional Safety Office. Was slice culturen in PBS drie keer voor 10 minuten elk. Natte monteren slice culturen om gelatine (of silaan) bekleed dia's met 100 ul afwasmiddel opgelost in gedestilleerd water. Droog 's nachts bij kamertemperatuur. Vermijd het gebruik van slide warmers overmatige hitte kan scheurvorming in culturen gemonteerd aan dia's. Uitdrogen dia's door middel van een serie van ethanolreeks (50, 75, 95, 95, 100, 100%) gedurende 30 seconden elk. Duidelijke dia's met xyleen vier keer tien minuten per stuk. Met behulp van een glas Pasteur pipet, plaats 0,1 ml van montage media op de top van glijden en zachtjes dekglaasje om luchtbellen te vormen voorkomen. Droog 's nachts bij kamertemperatuur. Fluorescerende immunokleuring. Sectie slice culturen tot 20 pm dikke met behulp van een cryostaat. Pas de cryostaat instellingen tot -16 ° C voor interne temperatuur, en -12 ° C voor object temperatuur. Plaats een kleine hoeveelheid water op metalen boorkop met behulp van een Pasteur pipet en bevriezing van droog ijs. Breng een dunne schijf laag van Tissue-Tek media op de top van bevroren chuck. Laat chuck te bevriezen en om cryostaat kamer temperatuur evenwicht. Sectie Tissue-Tek media om een ​​afgeplatte oppervlak geschikt voor het leggen slice culturen plat te creëren. Let op de oriëntatie van de boorkop tijdens het snijden dit zorgt voor een consistente hoek voor het snijden dat zal monteren media te voorkomen valt uit de boorkop. Toen bevroren, neem chuck uit en plaats in een houder. Met behulp van een metalen spatel en een boete-tip kwast, schuift een stukje cultuur op spatel en transfer naar demidden van de platte laag van Tissue-Tek media op de boorkop. Leg een dun laagje van de Tissue-Tek media via gemonteerd slice cultuur en bevriezen bij kamertemperatuur gedurende minstens 10 minuten. Met de "Trim" knop geactiveerd, onderdeel van de bovenste lagen van de Tissue-Tek media tot slice cultuur zichtbaar is. Omschakelen van "trimmen" naar "sectie" preset bij 20 micrometer. Pick-up 20 micrometer secties met gelatine gecoate dia's die zijn kamertemperatuur en droog dia's 's nachts. Tissue-Tek media zal zichtbaar zijn op dia's, maar lost in PBS gewassen. Immunokleuring. Was dia's in PBS drie keer voor 10 minuten elk. Quench in 0,3% H 2 O 2 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, schudden. Was dia's in PBS drie keer voor 10 minuten elk. Met behulp van SFX-signaal versterker, breng dan een paar druppels Component A direct op de top van secties op dia en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Incubatie met Component A vervangt de blokkering stap met 10% geit serum-oplossing uitgevoerd in helder veld immunohistochemie. Broed dia's in primair antilichaam verdund in 0,75% Triton X-100 in PBS gedurende twee uur bij 37 ° C. Rechtstreeks van toepassing zijn primaire antistof-oplossing naar de top van dia's en incubeer in vochtige kamer om verdamping te voorkomen. Neem geen serum in een van de antilichaam-oplossingen alleen gebruik maken van PBS en Triton X-100. Was dia's in PBS drie keer voor 10 minuten elk. Incubeer in secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur en beschermen dia's uit licht. Centrifuge alle fluorescerende secundaire antilichamen gedurende 20 min aan een aggregaten voorkomen dat in het antilichaam oplossing. Bereid antilichaam verdunning met 0,75% Triton X-100 in PBS. Was dia's in PBS drie keer voor 10 minuten elk. Dompel dia's eenmaal in gedestilleerd water te wassen zouten van PBS. Droog dia's 's nachts bij kamertemperatuur, bekleed weg van het licht. Dekglaasje dia's met ProLong Antifade media. Dooi Component A in de magnetron voor 5-10 sec en voeg ongeveer 1 ml tot een flacon Component B. Meng met behulp van een pipet Pastuer, zorg dat u luchtbellen te introduceren in de oplossing. Centrifugeer gedurende 5 min bij max. snelheid om luchtbellen te verwijderen. Breng een dun laagje ProLong media naar de top van dia een Pastuer pipet, zorgvuldig te voorkomen dat eventuele luchtbellen. Plaats voorzichtig dekglas op de top van dia's en 's nachts droog, bedekt de buurt van het licht. Double-label fluorescerende Immunokleuring (figuur 5). Voer fluorescerende Immunokleuring zoals hierboven beschreven, behalve verdunnen zowel primaire antilichamen in dezelfde incubatie-oplossing. Verdunnen alle secundaire antilichamen in dezelfde oplossing en incubeer zoals hierboven beschreven. Seriële incubatieperioden met behulp van twee antilichamen resulteerde in verminderde immunokleuring. 13. Representatieve resultaten Figuur 1. Uiterlijk van de hippocampus slice culturen en microglia. De linkerhand afbeelding toont een typische volwassen (dwz 21 dagen in vitro) hippocampus plak cultuur vlek met Neun (groen) om de cytoarchitecture van de belangrijkste neuronen te illustreren. Piramidale neuronen worden weergegeven in gebieden CA1 en CA3 en deukengyrus (DG) neuronen aten naar links. Schaal bar is 250 micrometer. De rechterhand beeld is afgeleid van het CA1 gebied en getoond op een hogere macht om de vertakte kwaliteit van de latente microglia illustreren binnen volwassen slice culturen. Cellen werden gemerkt met het microgliale oppervlak marker, CD11b. Schaal bar is 50 micrometer. Figuur 2. Koude-conditionering neuroprotectie in de hippocampus slice culturen. Culturen worden geïncubeerd met Sytox Green, een fluorescent gemarkeerde dode cel marker. De bovenste rij toont sham controle culturen en de onderste rij toont plakjes blootgesteld aan 28 ° C gedurende 90 minuten. Linkerhand, pre-screen beelden tonen geen CA1 letsel. Relatieve letsel kleurkalibratie schaal wordt weergegeven in de linker bovenste beeld. Middelste rij beelden tonen ten opzichte van slice cultuur letsel 24 uur na blootstelling aan 20 uM NMDA. Merk op dat sham controle letsel is groter dan die van culturen blootgesteld aan koude-preconditionering (CP). Traditioneel zijn culturen vervolgens blootgesteld aan 20 uM NMDA ene dag op CA1 neuronale verwonding niveau en de relatieve letsel van CP v. schijn te maximaliseren, vermeld als een verhouding van letsel / maximaal letsel. Echter, kan de blootstelling aan maximale letsel stimuli niet voldoende zijn om neuroprotectie te overwinnen vanuit de conditionering. Daarom is het gebruik van ratio's van letsel / maximaal letsel kan niet nauwkeurig neuroprotectie reflecteren vanuit de conditionering. Dit is duidelijk in de rechterhand beelden die tonen CP maximale niveaus zijn minder dan die van de sham controles. Figuur 3. Schematische illustratie van het nut van het gebruik van de eerste, de eerste dag metingen om letsel niveaus kwantificeren in koud-preconditionering experimenten. Zoals hierboven is opgemerkt, vonden we dat het gebruik van ratio's (letsel / maximaal letsel) kan neuroprotectie obscure van koud-pre-conditioning. Dit blijkt uit het schema aan de linkerkant waar de schijnvertoning letsel wordt getoond in het rood en dat na koude-voorconditionering in het blauw. Een dag na blootstelling aan koude NMDA-preconditionering toont een relatieve "3" niveau van de schade v. sham ("5") controle, in overeenstemming is met 40% neuroprotectie. Echter, als een traditionele formaat met behulp van ratio's (dat wil zeggen, letsel / maximaal letsel) wordt gebruikt, geen bescherming is duidelijk [dwz, (5 / 10) = 50% voor placebo v. (3 / 6) = 50% voor koude-preconditionering ]. Figuur 4. Typial qPCR resultaat worden weergegeven. Bovenste curve RNA aantal kopieën v. drempel cyclus voor PCR-amplificatie met controles (blauw) en experimentele monsters (rood). Onderste afbeelding toont typische versterking profielen voor vier monsters (zwart, groen, geel en paars). Let op de laatste Ct drempel cycli (gemarkeerd door oranje lijn) optreden bij 26,0, 29,5, 31,0 en 32,5. Figuur 5. Double-label immunokleuring gebruikt om qPCR en qPCR reeks resultaten bevestigen Een stuk cultuur was verwerkt voor IL-11 (rood) en Neun (groen, om neuronen te geven). Te probe voor de cellulaire expressie loci van IL-11. Merk op dat sommige piramidale neuronen (pijlen) IL-11 en Neun vlekken (geel) tonen, terwijl een paar kleinere cellen (pijlen), geacht astrocyten, blijkt alleen maar toegenomen IL-11 vlekken (rood).