Оценка устьичного Ответ на живые бактериальные клетки с использованием полного изображения листьев

1. Выращивание растений и подготовка бактерии Чтобы начать эту процедуру сеять семена арабидопсиса на 1:01:01 V: V: смесь питательная среда (Реди-земля плагин и рассады смесь, ВС Гру), декоративные вермикулит, перлит и. Рост растений в ростовой камере (22 ° С, 12 часов 100 мкмоль / мм 2 / сек дневного света и 65 ± 5% влажности) и воду по мере необходимости. Растения готовы к использованию через 4-6 недели, когда у них есть молодые листья полностью расширена до болтов. За два дня до начала эксперимента подготовить бактерии культуры. Pseudomonas syringae подряд из глицерина акций на изменение LB среде (10 г / л триптон, 5 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / л NaCl, рН 7,0, и 1,5% агара) и выдержать в течение 24 часов при температуре 28 ° C. Используйте свежие культуры подготовить посевной и всегда начинаются культуры плит из глицерина запасов как бактерии становятся менее вирулентным после высеве. Использование бактерий, которые росли на пластину, чтобы начать 10 мл жидкости культуры P. syringae в 50 мл колбу Эрленмейера. Инкубируйте культуру в течение ночи при 28 ° C с энергичного встряхивания, пока не достигнет оптической плотности или ОП при 600 нм от 0,8 до 1. Измерьте оптическую плотность при 600 и урожай клетки центрифугированием при 1360 мкг в течение 10 минут. Ресуспендируют клеток в дистиллированной воде, так что окончательный диаметр составляет 0,2. Это OD соответствует 10 8 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл. С бактериями готов, приступить к подготовке листья и началу анализа. 2. Окрашивание листьев и инкубации с бактериями Для того, чтобы пятно листьев сначала подготовить 20 мкМ иодида пропидий или PI раствора в воде. 10 мл раствора достаточно для окрашивания 3 маленьких листьев за один раз. Получить растений от роста камеры и щипцами отделить 3 молодых, полностью расширена листьев. Погрузите все листья в решение PI течение 5 минут. Затем удалите листья и промыть их кратко дистиллированной водой. Следующее место листа с нижней поверхностью вниз на предметное стекло микроскопа. Вырезать лист с острым лезвием бритвы на четыре части исключения середине вены, так что лист лежит плашмя на слайде. Для инкубации бактерий с листьями, добавить 300 мкл бактериальной суспензии под листом штук на слайде. Убедитесь, что нижняя поверхность листьев находится в контакте с посевной. Инкубируйте образцы на тех же условиях окружающей среды, которые используются для выращивания растений. В то время для наблюдения листья под микроскопом, передача листа части, чтобы новый слайд с нижней поверхностью вверх. Обратите внимание, что покровное стекло не используется при монтаже слайдов. Же образец листа могут быть отображены несколько раз во время инкубации и время курс может быть настроена в соответствии с целями исследования. 3. Микроскопии, измерения и анализа данных Здесь лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSM 510 Мета, Carl Zeiss, Inc) используется для проверки листьев. Обратите внимание на нижнюю поверхность листьев для обнаружения флуоресценции PI (возбуждение 453 нм, излучение 543 и 620 нм). Используя те же образцы листьев захвата изображений устьиц с течением времени. Сохранить изображение для измерения ширины устьичных диафрагмы. Мера устьичного ширина отверстия не менее 60 устьиц для каждой обработки в каждый момент времени с помощью браузера LSM изображения. Подсчитать средние и стандартные ошибки для устьичного ширину диафрагмы. Статистическая значимость результатов можно вычислить с помощью 2-хвост, соединенные мудрым Стьюдента-тест. 4. Представитель Изображения устьичного Ответ на Инкубация с бактериями Вот типичные микроскопические изображения (с использованием 20-кратным цель) Arabidopsis поверхности листа при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при ярком поле зрения (рис. 1). Пропидий йодида пятна клеточной стенки жизнеспособных клеток увеличения видимости охранника клеток в дополнение к возможности для идентификации неповрежденных клеток для сбора данных (рис. 2). Диапазон устьичных отверстий пор можно увидеть в этих снимках, с полностью закрытым устьиц на широко открытые устьица. Полностью закрыты устьица идентифицируются по форме охранника клетки (рис. 3). Отверстие шириной считается 0 мкм. Для открытых устьиц (рис. 4) отверстие шириной показано измеряется с помощью прямой линии, проведенной через самую широкую область устьичного поры. Это типичные экспериментальные результаты этого устьичного анализа. Arabidopis листьев инкубировали в темноте с тремя различными штаммами Pseudomonas syringae. Только бактерии Pst DC3000 смог открыть темно-замкнутых устьиц, измеряемое отверстие шириной 60 случайно выбранных устьиц на штамм бактерий (рис. 5). </oл> Рисунок 1. Микрофотография поверхности листьев Arabidopsis. Один в поле зрения листовой поверхности при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) с помощью 20-кратного объектива. Обратите внимание, что устьичного диафрагма не является столь очевидным, когда по сравнению с люминесцентными зрения помогали пропидий окрашивания йодида (рис. 2). Рисунок 2. Микрофотография поверхности пропидий йодо-окрашенных листьев Arabidopsis. Один в поле зрения листовой поверхности при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) с помощью 20-кратного объектива. Обратите внимание, диапазон устьичного открытия поры. Желтыми стрелками указаны полностью закрыть устьица и зеленые стрелки указывают на широко открытые устьица. Рисунок 3. Полностью закройте устьиц, определенные формы и отверстие между замыкающих клеток. Отверстие шириной считается 0 мкм. Рисунок 4. Открытое устьиц показывает диафрагму шириной в мкм. Измерения проводились с помощью LSCM браузер, основанный на прямой линии, проведенной через широкую область устьичного поры. Рисунок 5. Устьичного отверстие Arabidopsis листьев инкубировали с трех штаммов Pseudomonas syringae ру помидор:.. DC3118, DB29, а DC3000 растения находились в темноте во время экспериментов времени. Результаты представлены как среднее (п = 50-70) ± стандартная ошибка. Статистическая значимость была обнаружена с двумя хвостами Стьюдента-тест. Эксперимент был повторен три раза с аналогичными результатами.