Immunofluorescentie detectie van twee thymidine-analogen (CldU en IDU) in het jeugdwerk Tissue

1. Labeling Weefsels met CldU en IDU Los thymidine-analogen (CldU of IDU) in water. Weeg 1 mg / ml van elke chemische stof en toe te voegen aan glazen flessen gedestilleerd water te scheiden. We meestal voor te bereiden 1 liter van elk op een keer. Los van de chemicaliën op een roer plaat of andere vorm van agitator. CldU zal oplossen in 10 minuten. van agitatie bij kamertemperatuur. Idu vraagt ​​meer dan een uur van agitatie bij 37 ° C in een shaker. Waterbronnen van invloed kunnen zijn Idu oplosbaarheid. Als Idu blijft onvoorwaardelijke na een nacht schudden, probeer dan een schonere bron van water. De oplossingen worden opgeslagen bij 4 ° C in het donker. Dien de eerste thymidine bevattende oplossing (ofwel CldU of IDU) om de muizen voor de gewenste etikettering periode. Sta niet toe dat muizen om de toegang tot ongelabelde water hebben tijdens de periode van het etiket. Wanneer de aangewezen etikettering periode is afgerond, begint een wash-out met ongelabelde water gedurende tenminste 24 uur (de thymidine-analogen met serum halfwaardetijden van enkele uren). Dien de tweede thymidine bevattende oplossing (ofwel CldU of IDU) om de muizen voor de gewenste etikettering periode. Vullen flessen water regelmatig om uitdroging te voorkomen! Als alternatief kunnen muizen worden gelabeld door opeenvolgende intraperitoneale injectie van CdlU en dan IDU. Bereid CldU of IDU op 10 mg / ml concentratie. Idu kan verlangen druppelsgewijze toevoeging van geconcentreerde natriumhydroxide-oplossing gevolgd door heftig schudden in te gaan schorsing. Voeg geen teveel natriumhydroxide. Voeg een druppel van natriumhydroxide om een ​​10 ml oplossing van IDG, gevolgd door een uur roeren bij 37 ° C in een shaker. Als dat niet in oplossing, herhaal dan de toevoeging van natriumhydroxide. Injecteer 100 microgram per gram lichaamsgewicht in de intraperitoneale ruimte. Controle dia's zijn essentieel voor dit protocol. Als gevolg hiervan, raden we de onderzoekers voeren verschillende varianten van thymidine analoog etikettering sensitiviteit en specificiteit te garanderen. Hiertoe behoren onder andere: 1. Muizen die alleen werden gemerkt met CldU, 2. Muizen die alleen werden gemerkt met IDU, 3. Muizen die opeenvolgend werden gemerkt met CldU en dan IDU, 4. Muizen die opeenvolgend werden bestempeld in omgekeerde volgorde eerste, met IDU en dan CldU, 5 Muizen die zijn mock gelabeld met alleen water. Bij het leren label met CldU en IDU, moeten onderzoekers steeds uit te voeren van de gehele protocol met alle 5 hierboven sets van controle dia's uit het weefsel van belang. 2. Tissue Harvest, Fixatie, en Slide voorbereiding Met behulp van geschikte verdoving, uit te voeren dodelijke overdosis en dan offer muis via verbloeding. Verwijder de verse weefsel en bevestig met 4% paraformalehyde bij 4 ° C gedurende 24 uur. Overdracht weefsel tot 1:4 formaline buffer en bewaar bij 4 ° C voor het inbedden. Als alternatief, uit te voeren dodelijke overdosis en dan perfuseren de muis via de linker ventrikel met een zoutoplossing totdat de bloeddruk wordt gewist uit het lichaam, dan onmiddellijk perfuseren met 30-50 cc van 4% paraformaldehyde. Verwijder de weefsels van belang en op te slaan in 01:04 formaline Buffer bij 4 ° C voor het inbedden. Na het weefsel uitdroging en paraffine inbedding, cut 5-micron weefselcoupes en plaats op geladen dia's. Bak de dia's bij 65 ° C gedurende 16 uur om de hechting van weefsel te schuiven zorgen (essentiële met antigen herstel stappen hieronder). 3. Uitdroging, permeabilisatie en Antigen Retrieval Verwijder overtollige paraffine door onderdompeling van dia's in twee xyleen baden gedurende 5 minuten. elk. Hydrateren het weefsel door het onderdompelen van dia's in ethanol verdund met water: 100, 95, 90, 80 70 en 50%. Geniet van de dia's voor 3 minuten. voor elke concentratie, te beginnen met 100% en gaan tot 50% voor de laatste onderdompeling. Was dia's gedurende 5 minuten. in 1x PBS. Permeabilize cellen door onderdompeling dia's in 0,2% Triton-X-oplossing voor de 5 min (vers gemaakt elke keer). Bereid je dia's voor magnetron weefsel antigen herstel. Plaats de dia's in een glazen beker met een voldoende volume 0,01 M pH 6,0 natriumcitraatbuffer, zodat de oplossing 5 cm boven de bovenkant van de dia's om rekening te houden verdamping verliezen dekt. Magnetron dia's tot de oplossing koken (3-10 min. Op volle kracht). Verlaagt het stroomverbruik tot de oplossing wordt langzaam koken (10-80%) en blijven voor een extra 20 minuten. Controleer regelmatig of magnetron om ervoor te zorgen de oplossing blijft op een langzame kook. Plaats bekerglas met dia's op een bench-top en laat zachtjes afkoelen tot kamertemperatuur, (ongeveer 2 uur). Bevestigen dat de dia's zijn bij kamertemperatuur met behulp van een thermometer. Dompel dia's in 1.5N HCl gedurende 40 minuten. bij kamertemperatuur. Was dia's tweemaal in 1X PBS, 5 minuten. per wasbeurt. 4. Primaire en secundaire antilichamen Het is belangrijk dat de dia's blijven zeer vochtig door het hele protocol. Droge tissue zal veel meer auto-Fluorescentie, waardoor de resulterende beelden onbruikbaar. Om te voorkomen dat sterven, proces een dia per keer. Cirkel elke sectie op de dia's met een vloeistof te blokkeren (dat wil zeggen, was) pen. Plaats de dia's in de container van 1x PBS. Maak een vochtige incubatiekamer door het plaatsen van natte papieren handdoeken plat op de bodem van een luchtdichte plastic verpakking. Make-up blokkering oplossing van 10% ezel serum verdund in 1x PBS. Het is belangrijk om volledig te dekken elke sectie met de oplossing. Voor weefselcoupes die zijn 1 x 1,5 centimeter, een volume van 50 micro-liter van de oplossing per sectie is voldoende. Voeg de blokkering oplossing voor de dia's. Verwijder de dia uit 1x PBS en te elimineren overtollige vloeistof door zachtjes te tikken op de rand glijden op een stapel van droge papieren handdoekjes. Plaats dia in incubatiekamer en voeg 50 micro-liter van 10% te blokkeren oplossing voor elke sectie. Wanneer alle dia's zijn afgerond sluit de kolf en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bereid primaire antilichaam te verdunnen tot Idu op te sporen. Verdunnen muis anti-BrdU in een 1:250 concentratie in 5% ezel serum gemaakt in 1x PBS. Kraan af block-oplossing van dia en plaats terug in de incubatiekamer. Voeg de bovengenoemde primaire antilichaam voor elk artikel en incubeer overnacht bij 4 ° C. Bereid hoge stringentie was (die binding minimaliseert door muis anti-BrdU antisera te CldU). Make-up verse laag zoutgehalte TBST buffer (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% Tween-20, pH 8,0). U moet 40 ml buffer per paar geleiders. Voeg 40 ml buffer voor elke 50 ml conische buis. Voor het toevoegen van dia's, verwarm de oplossing tot 37 ° C. Twee in een tijd, verwijder dia's uit de incubatiekamer, plaats ze back-to-back (zodat weefselmonsters af gezicht van elkaar) en tik het overtollige primaire antilichaam. Plaats de dia's in de buizen gevuld met een laag zout TBST en te dekken. Schud de buizen gedurende 20 minuten. in een schuddend bacteriecultuur incubator met de temperatuur op 37 ° C, en de snelheid ingesteld op 225 rpm. Was de dia's twee keer in verse 1X PBS. 5 minuten. per wasbeurt. De voorbereiding van de volgende primaire antilichaam oplossing voor de detectie van CldU en weefsel-antigeen, indien gewenst. Verdunnen rat anti-BrdU in een 1:250 concentratie in 5% ezel serum gemaakt in 1x PBS. Verdunnen primaire antisera tegen weefsel antigen bij het werken concentratie in de primaire antistof oplossing. Tik overtollige 1x PBS off van de dia's en plaats ze in de incubatiekamer. Voeg primaire antistof aan elke sectie en incubeer overnacht bij 4 ° C. Was de dia's twee keer in verse 1X PBS. 5 minuten. per wasbeurt. Bereid de secundaire antilichaam oplossing. Verdunnen Cy2 ezel anti-rat naar 1:250 en Cy5 ezel anti-muis 1:500 in een 1X PBS oplossing met 5% ezel serum. Voeg Cy3 tweede naar de eerste soorten van weefsel antigen antisera te detecteren. Ook verdun een 0,4 mg / ml stockoplossing van DAPI te 1:150 in het secundair antilichaam oplossing. Tik overtollige 1X PBS uit dia's en plaats in de incubatiekamer. Voeg secundair antilichaam oplossing voor elke sectie en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Was de dia's twee keer in verse 1X PBS. 5 minuten. per wasbeurt. Tik overtollige 1X PBS off van de dia's en zich te dekken glas met Verleng Gold anti-fade montage media (NIET Vectashield gebruik met dyanine kleurstoffen!). Druk op dekglaasjes om luchtbellen te verwijderen. Bewaren bij 4 ° C. 5. Beeldvorming en analyse Beeld dat de weefsel van belang met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een hoge energie-lichtbron, plan-apochromatische doelstellingen, en een hoog rendement microscoop camera (bijv. Hamamatsu Orca ER). Maak foto's in het AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (Tissue antigeen), en Cy5 (IDU) kanalen. Afbeeldingen samenvoegen tot een enkele multi-layer image bestand te maken. Indien correct uitgevoerd, zal DAPI gekleurde kernen worden homogeen licht. Tissue antigeen (bijv. insuline) moet uitwijzen cellen van belang. Als kleuring met DAPI of weefsel-antigeen is zwak of inconsistent, dompel dia in 1X PBS 's nachts te verwijderen dekglas en herhaal de toepassing van secundaire antisera. Focus op weefsel-antigeen in Cy3. Controleer CldU en IDU kleuring in Cy2 en Cy5 kanalen, schakelen tussen kanalen. Kijk voor potentiële kruisreactiviteit tussen de markers, zoals aangegeven door overmatige IDG en CldU co-positiviteit. Kijk voor weefsels die alleen CldU of Idu bevatten. Gebrek aan CldU of ID-positieve kernen kan duiden op een technisch probleem met de etikettering of vlekken. In dit geval, kijk voor een zeer replicatie weefsel (bijvoorbeeld lymfeklier). Analyseren van beelden. Scherm lagen die DAPI en weefsel antigeen. Met behulp van een white board marker in de dominante hand en een cel balie in de niet-dominante hand, merk elke kern met een contrasterende markering met een droog uitwisbare marker (aka white board marker). Count DAPI positieve cellen in weefsel van belang. Record totaal aantal cellen. Gebruik een droge wisser om vlekken te verwijderen. Scherm laags met DAPI, weefsel-antigeen, en CldU. Count CldU positieve cellen in weefsel van belang. Record CldU celgetal, maar niet wist merken. Wijzig weergave op lagen die weefsel antigen, CldU, en IDU te visualiseren. Count CldU Idu dubbele positieve cellen. Record waarde, wist u alle merken, en weer lagen die DAPI, weefsel-antigeen, en IDU. Tel het totaal aantal ID-positieve cellen in het weefsel van belang. Record Idu celgetal. 6. Representatieve resultaten We sequentieel 6 week oude vrouwelijke muizen gelabeld met CldU voor een week en dan IDU gedurende twee weken, gevolgd door onmiddellijke offer. Pancreata werden gekleurd om CldU, IDU en insuline (een tissue antigen), evenals DAPI te detecteren. Eilandjes werden gelijkmatig gekleurd met insuline. CldU gekleurde kernen werden onderscheiden van IDU-lood kernen (figuur 2). Veel kernen buiten het eilandje waren CldU IDU co-positief (figuur 2, rechts onderin, witte pijlen). Een enkele insuline positieve cel had nucleaire kleuring voor zowel CldU en IDG (figuur 2, rechtsonder, magenta pijl). Muizen. Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de IACUC comite van de Children's Hospital van Philadelphia. Vrouw B6.129 F1 wild-type muizen werden gekocht bij Taconic (Germantown New York), ondergebracht bij het proefdier faciliteit in The Children's Hospital van Philadelphia, en gevoed Mouse Dieet 5015 van PMI Nutrition International (Richmond. Indiana). Labeling strategie. Door het labelen van de eerste celdeling evenement met CldU (groen gemarkeerd in deze regeling) en de tweede celdeling met IDU (rood gemarkeerd in deze regeling), sequentiële celdeling resulteert in co-gelabelde cellen met zowel CldU en IDG (groen / rood) . Representatieve resultaten van thymidine etikettering van pancreatische cel omzet binnen muizen. Immunofluorescentie afbeelding van een muis pancreas met eilandje van Langerhans in het centrum. Muis was doordrenkt met CldU voor 1 week en daarna IDU voor 2 weken in het drinkwater voorafgaand aan de onmiddellijke offeren. Pancreas monster werd verwerkt zoals beschreven in het protocol. 40x objectief beelden met verschillende lagen weergegeven die geschikt zijn voor het tellen. Samengevoegde beelden bevatten DAPI (wit) CldU (groen), IDU (rood), Insuline (geel). (Boven, links) DAPI en insuline. (Boven, rechts) CldU en insuline. (Lager, links) IDU en insuline. (Lager, rechts) CldU, IDU, en insuline. Schaal bar: 100 urn. Figuur 1. Labeling strategie. Door het labelen van de eerste celdeling evenement met CldU (groen gemarkeerd in deze regeling) en de tweede celdeling met IDU (rood gemarkeerd in deze regeling), sequentiële celdeling resulteert in co-gelabelde cellen met zowel CldU en IDG (groen / rood) . Figuur 2. Representatieve resultaten van thymidine etikettering van pancreatische cel omzet binnen muizen. Immunofluorescentie afbeelding van een muis pancreas met eilandje van Langerhans in het centrum. Muis was doordrenkt met CldU voor 1 week en daarna IDU voor 2 weken in het drinkwater voorafgaand aan de onmiddellijke offeren. Pancreas monster werd verwerkt zoals beschreven in het protocol. 40x objectief beelden met verschillende lagen weergegeven die geschikt zijn voor het tellen. Samengevoegde beelden bevatten DAPI (wit) CldU (groen), IDU (rood), Insuline (geel). (Boven, links) DAPI en insuline. (Boven, rechts) CldU en insuline. (Lager, links) IDU en insuline. (Lager, rechts) CldU, IDU, en insuline. Schaal bar: 100 urn.