אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר ספין האלקטרון תהודה (שקיעת דם) מיקרו הדמיה שיטת מיפוי תלת ממדי של רמות החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים עם מיקרון בקנה מידה ברזולוציה 1. החמצן הוא אחד מולקולות החשובות ביותר במחזור החיים. היא משמשת acceptor מסוף אלקטרונים של זרחון חמצוני במיטוכונדריה והוא משמש בייצור של מינים חמצן תגובתי. מדידות של חמצן חשובה לחקר פונקציות המיטוכונדריה ואת חילוף החומרים, מסלולי איתות, ההשפעות של גירויים שונים, חדירות הממברנה, והבחנה המחלה. צריכת חמצן ולכן הוא סמן אינפורמטיבי של חילוף החומרים הסלולר, אשר החלים רחב במערכות ביולוגיות שונות המיטוכונדריה לתאים לאורגניזמים כולו. בשל חשיבותו, שיטות רבות פותחו עבור מדידות של חמצן במערכות חיים. ניסיונות נוכחי לספק ברזולוציה גבוהה הדמיה חמצן מתבססים בעיקר על הקרינה אופטיים ושיטות זרחני כי אינם מצליחים לספק תוצאות משביעות רצון כפי שהם מעסיקים בדיקות רעילות עם תמונה גבוהה ורגישות חמצן נמוכה. שקיעת דם, אשר מודד את האות בדיקות פאראמגנטיים אקסוגניים במדגם, ידוע לספק מדידות מדויקות מאוד של ריכוז החמצן. במקרה טיפוסי, מדידות שקיעת דם המפה הרחבת lineshape של בדיקה ו / או רגיעה בזמן קיצור כי הם קשורים ישירות לריכוז חמצן המקומית. (החמצן הוא פאראמגנטיים, לכן כאשר מתנגשות עם החללית פאראמגנטיים אקסוגניים, זה קוצר פעמים הרפיה שלה.) באופן מסורתי, אלו סוגים של ניסויים מתבצעות עם רזולוציה נמוכה, מילימטר בקנה מידה שקיעת דם הדמיה חיות קטנות. כאן אנו מראים כיצד שקיעת דם הדמיה יכולה גם להתבצע בהיקף מיקרון עבור הבדיקה של דגימות חי קטן. שקיעת דם מיקרו הדמיה היא מתודולוגיה חדשה יחסית המאפשרת רכישה של אותות שקיעת דם מרחבית נפתרה עם רזולוציה מתקרב 1 מיקרון בטמפרטורת החדר 2. המטרה העיקרית של נייר פרוטוקול זה היא להראות כיצד השיטה החדשה, יחד עם חמצן רגיש בדיקות החדש שפותח, יכול להיות מיושם על מיפוי של רמות חמצן בדגימות לחיות קטנות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה גם ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מראה כיצד שקיעת דם מיקרו הדמיה יכול להיות מיושם על המפה ריכוז החמצן ליד דגימות קטנות לחיות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג. בעתיד הקרוב אנו מתכננים להמשיך ולשפר את המתודולוגיה לספק תמונות מדגם לחיות עם רזולוציה של מיקרונים אחדים, מתן פרמטרים כגון ניגודיות ריכוז תחמוצת סופר, חומציות (pH), מקדם בדיקה דיפוזיה, כמובן, ריכוז החמצן. יכולות אלה משלימים האופטי מבוסס מתודולוגיות הנוכחי הן מבחינת סוג בניגוד וגם דוגמאות של מאפיינים (למשל, לא שקוף דגימות עבה, במקרים מסוימים, מדידות תאיים לעומת תאיים).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | ||
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |||
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | |||
| Syringe | Hamilton | Microliter 7000.5 | ||
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why?. NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. . EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
