二重蛍光その場でハイブリダイゼーション
Summary
このプロトコルは、非放射性の関係<em>その場</em脊椎動物の脳の薄片で、単一セルの解像度で、二つの転写産物の種の同時同定を可能にする>ハイブリダイゼーション手順。
Abstract
ここでは、二重蛍光の修正版を説明<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション（dFISH）メソッドでは、新鮮凍結脳切片における関心のある2 mRNAを検出するために最適化。当社グループは、正常遺伝子の共同規制を研究するためにこのアプローチを使用しています。具体的には、我々は単一細胞の解像度で、解剖学的組織、神経化学的特性、および中央の感覚回路の感覚経験の影響を調べるためにこのdFISHのメソッドを使用している。このプロトコルは、マウス、ラット、鳴禽類の脳組織で検証されていますが、非神経組織の配列にだけでなく、他の脊椎動物種に容易に適用可能であることを期待されている。この映画では、この手順の主なステップの詳細なデモンストレーションを提供しています。
Protocol
このプロトコルは、以前は脳組織1-7に、1つまたは2つの転写産物の種を検出するために私達と他の人によって開発された標準的な放射性および非放射性in situハイブリダイゼーション法をベースに開発し、精製した。以下に記述されているプロトコルは、エンドユーザーによって選択された手続きの中断の数に応じて、2または3日間の合計の長さを持っています。以下に詳述する…
Discussion
我々は、脊椎動物の脳がneurochemicallyと機能的に編成されているか研究し、そしてどのように行動に関連した感覚刺激の影響成人の脳の8-10の神経細胞のゲノム機械かを判断するためにこのプロトコルを使用している。我々は正常マウス、ラット、鳴禽類の脳組織でこのメソッドを使用していましたが、このプロトコルは、脊椎動物種の配列と、おそらく、非神経組織から得られた脳切?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH / NIDCDとRPへのシュミット財団の助成金によってサポートされている動作。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
| PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
| Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
| Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
| DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
| Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
| RNasin | Promega | N2111 | ||
| BSA | Sigma | 05491 | ||
| DTT | Sigma | D5545 | ||
| Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
| EDTA | VWR | 101384-758 | ||
| SDS | Sigma | L4390 | ||
| Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
| 10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
| Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
| NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
| SSPE | VWR | 82021-488 | ||
| Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
| Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
| Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
| Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
| Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
| Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
| TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
| TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
| Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
| Vectashield | Vector | H-1000 | ||
| embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
| cryostat | Leica | CM 1850 | ||
| Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions
- Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
- Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
- TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
- TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
- TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
- Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
- Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.
References
- Jin, L., Lloyd, R. V. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).
- Stoler, M. H. In situ hybridization. Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).
- Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).
- Kessler, C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology–a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).
- Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts. Biotechniques. 18, 300-307 (1995).
- Qian, X., Lloyd, R. V. Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization. Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).
- Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds. Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).
- Pinaud, R. GABAergic neurons participate in the brain’s response to birdsong auditory stimulation. Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).
- Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. Co-induction of activity-dependent genes in songbirds. Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).
- Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression. J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).
- Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
- Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).
Cite This Article
Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).