De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

1. Introductie In deze video, zullen we laten zien hoe je Drosophila hersenen en retinae voor te bereiden op live-beeldvorming en immunohistochemie met een focus op fotoreceptorcellen. Eerst zullen we zien hoe voor te bereiden op de hersenen dissecties. Vervolgens zullen we zien twee fundamentele dissecties vaak gebruikt voor immunohistochemie dat de basis voor de live voorbereidingen te vormen. Deze twee preparaten zijn de volwassen hersenen en ogen dissecties. Vervolgens zullen we demonstreren de dissecties gebruikt voor live beeldvorming van de volwassenen en het ontwikkelen van de hersenen met de nadruk op hun gebruik voor live beeldvorming van fotoreceptoren. Tot slot beschrijven we hoe we foto levend weefsel en tonen enkele voorbeelden van live-imaging met behulp van resonante confocale microscopie. 2. Dissection voorbereiding Voor een goede dissecties, moet je scherpe tang. Gebruik van een aanzetstaal blok of zeer fijn schuurpapier (> 1500), voorzichtig langs de tang heen en weer op elke kant totdat de eindjes aan elkaar op een fijne punt. We maken gebruik van een standaard slijpsteen. We zullen niet voor de verscherping techniek hier, maar er rekening mee dat scherp forceps essentieel zijn voor live dissecties. We slijpen tang voor elke dissectie. Voor de volwassen hersenen dissecties, plaats de vliegen op een CO 2 pad om ze te verdoven en te sorteren op de gewenste genotype. Voor pupal dissecties, eenvoudig te bereiken in de flacon en voorzichtig een pop te verwijderen met uw tang, en let om te voorkomen dat het breken van de popstadium geval. Bevochtig een Kimwipe met water. U gebruikt deze tijdens de dissectie om vuil te verwijderen van uw tang. Plaats een dissectie schotel op het toneel van een stereoscoop en vul deze met HL3 oplossing 1. Alle dissecties zal worden uitgevoerd in HL3 om ervoor te zorgen dat het weefsel blijft levend en gezond tijdens de dissectie procedure. Ook maken we gebruik van een dissectie schotel die een bodem bedekking van Sylgard om verlostang te beschermen tijdens de dissectie heeft. Nu bereiden de vaststelling oplossing als u van plan bent immunohistochemie uit te voeren. Plaats 180μL van HL3 in een 500μL microcentrifugebuis. Voeg 20μL van 37% formaldehyde aan een 3,7% formaldehyde-oplossing te verkrijgen. Tot slot, de juiste houding van de handen is belangrijk voor een goede dissecties. Met een goede positie van de hand, zal je pincet gelijkmatig zijn en in staat van gecontroleerde, subtiele bewegingen. Plaats eerst de tang aan de zijkant van je duim. Breng dan de wijsvinger recht naar beneden, zodat het topje van de vinger rust op de top. Nu rest de zijkant van de tang aan de zijkant van je middelvinger en naar de dissectie schotel. Maak lichamelijk contact met het gerecht door uw duim en middelvinger. Tijdens het rusten uw duim en middelvinger op de schotel, plant je pols op de microscoop podium. Op deze manier heb je drie punten stevig op oppervlakken tijdens de dissectie en het is nu mogelijk om zeer subtiele manipulaties van de tang. Deze techniek kan een beetje ongemakkelijk te voelen op het eerste, maar met de praktijk, zult u binnenkort een meester van de hersenen dissecties. 3. Volwassen hersenen Op de CO 2-pad, oriënteren een volwassen vlieg buikzijde met het hoofd uit de buurt van je hand. Pak de borstkas net onder de kop. Als dit goed wordt gedaan, zal de benen en proboscis uit te breiden. Tijdens het bekijken onder een stereoscoop, pak de verlengde snuit met de tang aan het hoofd te verwijderen. Gooi het lichaam en onder water het hoofd. Heroriënteren op de verzonken kop. De hele dissectie zal worden uitgevoerd onder oplossing. Het is zeer belangrijk om op de kop te houden met een tang te allen tijde. Anders zal het hoofd zweven en is moeilijk te halen. Als het hoofd beweegt niet scherp tijdens de dissectie, gewoon terug naar het in het brandvlak, zonder het aanpassen van de microscoop. Deze schijnbaar eenvoudige taak kan moeilijk zijn op het eerste, maar waarbij je je hoofd in focus zal makkelijker in de tijd. Begin de dissectie door eerst te scheuren het bindweefsel tussen de proboscis en het oog. Scheur door het oog terwijl u stevig met ten minste een pincet te allen tijde. Zeker te zijn dat de teen van de tang alleen is net onder het netvlies of de nagelriem, om te voorkomen dat schade aan de hersenen eronder. Afwisselend links en rechts, gebruik je tang te scheuren weg het netvlies, werken aan de achterkant van het hoofd. Scheuren weg het netvlies zal de kans dat de lamina blijft verbonden aan de optische lob in deze dissectie. Ga verder rond de achterkant van het hoofd, scheuren cuticula langs de weg. Scheur door het andere oog en beginnen wegrijden cuticula. Zolang je grijpen nagelriem, u weet dat u niet het pletten van de hersenen! Met dit in gedachten, nog steeds cuticula en het netvlies weg te trekken tot aan de hersenen is onthuld. Zodra de hersenen zichtbaar is, kunt u beginnen met het verwijderen luchtpijp aan de hersenen (Fig. 1A). Verder te trekken in luchtpijp en cuticula totdat de hersenen is geïsoleerd. Op dit punt moet je concentreren op de bodem van de schotel voor thij de resterende stappen. Verwijder de resterende luchtpijp, omdat je hersenen anders kan drijven tijdens de nacht antilichaam wasbeurten. Voor de beeldvorming van fotoreceptor terminals, is het wenselijk om de lamina behouden, maar je moet het netvlies, die de cellichamen en sterk autofluorescente pigment bevat te verwijderen. Om dit te doen, trek aan de bossige en gepigmenteerde cellulaire blijft zonder beschadiging van de lamina. Dit is een fijner vaardigheid en vergt oefening. De volwassen hersenen levend gehouden kan worden voor de uren of zelfs dagen onder omstandigheden die we zullen bespreken in hoofdstuk 6. Voor immunohistochemie, het volwassen brein is nu klaar om te worden vastgesteld in formaldehyde. 2 Gebruik een P20 pipetteman ingesteld om 5μL de volwassen hersenen te verplaatsen naar de vaststelling oplossing die u al hebt voorbereid. Ga verder ontleden volwassen hersenen gedurende 20 minuten, dat moet 40 tot 10 hersenen opleveren. Laat de hersenen in de oplossing voor een extra 40 minuten, maar dit duur kan variëren voor een optimaal primair antilichaam kleuring. Verwijder de formaldehyde-oplossing en spoel de hersenen drie keer voor vijf minuten elk in 400μL van een oplossing die PBS en 0,4% TritonX-100, hierna te noemen PBS-Triton. Na het volledig wassen van de fix oplossing, kunt u toevoegen primair antilichaam oplossing. 4. Volwassen ogen Begin deze dissectie zoals beschreven voor de volwassen hersenen. Na het onderdompelen van het hoofd en de heroriëntering van de microscoop, beginnen met het scheuren van het bindweefsel tussen de proboscis en het oog. Boven de snuit, scheid de cuticula van het oog. Nu, los van de cuticula van de onderkant van het oog, werken aan de achterkant van het hoofd. Met een pincet, pak het midden van de achterkant van het hoofd. Met de andere, pak het oog en trekken. Laat het oog om zich te vestigen op de bodem van de schaal (Fig. 1B). De lamina zal waarschijnlijk nog worden bevestigd aan het oog en kan gebruikt worden voor live beeldvorming van de terminals van volledig intact fotoreceptorcellen op dit moment. Om door te gaan met live in beeld brengen van fotoreceptorcel lichamen, gaat u naar sectie 4.5. De volgende drie hoofdstukken uit te leggen vaste oog immunohistochemie. Voor immunohistochemie, verplaats het oog op de vaststelling van oplossing met behulp van een P20 pipetteman ingesteld op 5μL. Ga verder ontleden volwassen ogen voor een totaal van 10 minuten. Laat de ogen in oplossing voor een extra 30 minuten. Verwijder de fix-oplossing en het gedrag wast, zoals beschreven in het volwassen brein dissectie. Als u uiteindelijk wilt het imago van de ommatidial structuur van het oog van de lamina moet nu verwijderd worden. Zet de vaste ogen om je ontleden schotel en verwijder de luchtpijp of vet cellen die nog kunnen worden verbonden. Vervolgens terwijl de buitenkant van het oog met een tang, verwijder de lamina met de andere. Het moet uit te komen in een stuk, waardoor de cellbodies onder (Fig. 1B). Wees voorzichtig om de lamina alleen pakken! Anders loop je het risico verwijderen van de fotoreceptoren van het netvlies. Met behulp van een P20 pipetteman, verplaatst u de ogen om 400uL PBS-Triton in een 500uL buis. Voorzichtig ze 's nachts rots bij 4 graden ten opzichte van de autofluorescente rode pigment van de fotoreceptoren te verwijderen. De volgende dag, kunt u gooi de wasoplossing en voeg primair antilichaam oplossing. Voor de live-imaging van volwassen ogen gebruiken we alleen pharate volwassen vliegen, dat wil zeggen laat stadium poppen kort voor Eclosion. In dit stadium, de fotoreceptorcel instanties die losstaan ​​van terminals in de lamina tijdens de dissectie. Pharate volwassen poppen hebben goed gedefinieerde vleugels, ogen, en cuticula zichtbaar door de popstadium geval. Selecteer een pop en verwijder het voorste deel van het popstadium zaak naar het hoofd gebied bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het dunne binnenste membraan dat bovendien omsluit de zich ontwikkelende vliegen. Pak de onderkant van het hoofd met je pincet en trek. Gooi de rest van de pop terwijl de kop onder water. Ga te werk zoals aangetoond in het oog dissectie voor immunohistochemie. Op de pharate volwassen stadium, echter, zal de fotoreceptorcel lichaam gemakkelijker los te maken van de lamina, waardoor u het imago van de cellichamen gelegen in het netvlies. Ook de lamina blijft aan de optische kwab, zodat u het imago van de distale lamina. Als u het imago van de proximale lamina, waar de fotoreceptor terminal cartridges kunnen worden gezien, voer dan de ogen dissectie op een volwassen vlieg waar de lamina is meer sterk gehecht aan het oog. 5. Het ontwikkelen van eye disc-brain complexen De zich ontwikkelende oog schijf op 20% popstadium ontwikkeling (P +20%) is uitgegroeid tot een favoriet voor live-imaging in ons lab, omdat deze enkele laag van relatief grote ontwikkelingslanden cellen is makkelijk waarneembaar met behulp van confocale microscopie. 3 Het selecteren van een 20% pop, kijk voor de malpighian tubuli, een groene vlek verschijnt onder de pupal geval is, en vermijden poppen die een 'donkere lichaam "4 hebben. Na het selecteren van een P +20% pop, onderdompelen in HL3 in uw ontleden schotel en verwijder voorzichtig een voorste deel van het popstadium zak, en letniet aan de dunne binnenste membraan dringen. Pak de binnenste membraan met je pincet en uit elkaar te trekken. Zorgvuldig zoeken in de vrijgekomen inhoud aan de zich ontwikkelende hersenen en ogen schijven die zijn vrij prominent (Fig. 1C) te vinden. Het oog disc-brein-complex is gemakkelijk uit elkaar in deze fase van de metamorfose. Isoleer de hersenen op de bodem van de schotel ontleden. Haal voorzichtig de centrale hersenen van de optische lob. De optische lob / eye disk zal worden gebruikt in live beeldvorming. 6. Live-Imaging: Bij de microscoop Wilt u de afbeelding voor een een korte tijd in slechts een of twee oplossingen, kunt u het beeld van uw weefsel op een glasplaatje. In dit geval, bereiden de glijbaan door eerst het bekleden van het oppervlak met Sylgard met behulp van instructies van de fabrikant. Plaats 20μL HL3 in het midden van de dia. Vervoer uw ontleed weefsel in 20 extra ui van HL3 aan de dia. Het weefsel moet NOOIT worden blootgesteld aan lucht. Daarnaast moet elke stress of spanning uit pipet behandeling of oplossing oppervlaktespanning worden vermeden. Voor live imaging, moet het weefsel stevig worden vastgezet met een minimale behandeling en contact. We stevig de hersenen met behulp van de water-polymerisatie van chirurgische lijm GluShield toegepast door middel van een micro-elektrode positie, een techniek die routinematig gebruikt voor de embryonale voorbereidingen voor elektrofysiologie 5. Verkrijgen van een glaselektrode zoals die getrokken voor elektrofysiologische opnames. Breek de tip en vul het einde met GluShield met behulp van negatieve luchtdruk die door de mond. Breek alleen genoeg van de elektrode die lijm kan komen. Gebruik nu de positieve druk om een ​​kleine hoeveelheid lijm van toepassing op de Sylgard onder een daling van HL3. Nu, snel in het weefsel op de lijm, het handhaven van de gewenste richting voor live imaging. Een water-immersie lens kan nu gebruikt worden voor de beeldvorming. Wilt u een membraan permeabel kleurstof toe te voegen, kunt u deze toevoegen aan het bad, terwijl beeldvorming. We maken gebruik van een Resonant scanning confocale microscoop die snelle beeldvorming maakt met een verminderde fotobleken. 6 Voor beeldvorming over lange perioden van tijd of te wisselen oplossingen volledig of meerdere keren, gebruiken we een perfusie kamer (Harvard IC30 confocale imaging kamer) die wordt aangesloten op een peristaltische pomp dat perfuses langzaam kweekoplossing over het levend weefsel (Fig. 2A). Beweging van een constante uitwisseling vloeistof en een minimum aan GluShield contact verminderen van de afvlakking van het weefsel dat werd gemeten over een langere periode 7. Merk op dat voor de beeldvorming van ontwikkelings-perioden, de ogen disc-hersenen complex moet blijven intact en dient minimaal contact met de lijm te hebben. Gebruik een dekglas bedekt met een druppel Sylgard dat is geschoren te maken te dun en plat. Verdeel 20μL HL3 op het midden van het dekglaasje en lijm het levend weefsel van de Sylgard. Genereer een pakking die het mogelijk maakt bellen om door de kamer gaan zonder het blootstellen van het levend weefsel in de lucht (Fig. 2B). De pakking moet dik genoeg zijn om te voorkomen dat het neerslaan van de weefsels, maar dun genoeg om het weefsel dicht bij de confocale microscoop lens te brengen; we gebruiken 250μm in onze setup. Monteer de perfusie kamer, let daarbij goed op het weefsel volledig onder water te allen tijde te houden. In eerste instantie beginnen perfusie met een snelheid dicht bij 100μL per minuut met behulp van een peristaltische pomp. Deze snelheid is vrij snel, afhankelijk van de pakking dikte die de kamer hoogte definieert. Voor de beeldvorming op de schaal van uren, kan het nodig zijn 20-hydroxyecdyson en antibiotica, maar niet antifungale toe te voegen, en perfusie presteren op veel lagere snelheden rond 10μl per minuut. Ten slotte hebben we bubble zuurstof in het kweekmedium dat de perfusie kamer levert. 7. Representatieve resultaten: Aan het einde van onze video-protocol tonen we een voorbeeld voor live imaging in de ontwikkeling van fotoreceptorcellen met behulp van de voorbereiding gepresenteerd in hoofdstuk 5. Deze voorbereiding maakt gebruik van Drosophila transgenese tot cel-specifiek express fluorescerende verslaggevers. In het voorbeeld zijn twee TL-reporters uitgedrukt onder controle van de fotoreceptor-specifieke GMR-Gal4 driver 8: het membraan-gelabeld myrRFP en de endosomale marker 2xFYVE-GFP 9. Twee-kanaals 3D-datasets met een selectiekader van 70x70x17.5μm en een voxel grootte van 137x137x700nm (512x512x26) werden verkregen elke 1 minuut. De film toont een geselecteerde vlak na verloop van tijd in deze 4D dataset dat de dynamiek van intracellulaire endosomale mensenhandel en blaasje fusie gebeurtenissen onthult. Representatieve beelden voor vaste weefsel voorbereidingen van het oog en de lamina worden getoond in Fig. 3.