Прямое возобновление репликации Форк блокировалось Головой об РНК-полимеразы

Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Померанц и О'Доннелл, 327 Наука, 590-592 (2010) . 1. Ассамблея остановилась комплекс удлинение РНКП была выполнена следующим образом: 500 нМ конечная концентрация E. кишечной РНКП σ 70 HE смешивали с 5 нМ конечная концентрация биотинилированного 3,6 кб ДНК шаблон, содержащий T7A1 промоутер в 100 мкл буфера (20 мМ Трис-Cl (рН 7,5), 8 мМ MgCl 2, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT, 10% глицерина) в течение 10 минут при температуре 37 ° C. 100 мкМ ВСУ и 40 мкМ каждого из ГТФ, АТФ и CTP были добавлены в течение дополнительных 10 минут при температуре 37 ° C. 2. Иммобилизация остановился комплекса РНКП на удлинение бисером стрептавидин проводился следующим образом: 200 мкл стрептавидином магнитных покрытием шариков (Invitrogen) были добавлены к реакции выше в течение 10 мин при комнатной температуре. 3. Очистка иммобилизованных остановился комплекс удлинение РНКП была выполнена следующим образом: Шариков (сверху) промывают 5 раз с 0,9 мл буфера А, содержащего 0,75 М NaCl, 200 мкг / мл гепарина и 20 мкг / мл оцДНК (супернатант удален после каждого мытья шаг за магнитной сепарации.) Далее, бисер промывали 2 раза с 0,9 мл буфера А. 4. Формирование репликации вилки вниз по отношению к лобовым РНКП была выполнена следующим образом: Шариков (сверху) ресуспендировали в 100 мкл Новой Англии Биолабс буфер 4 и 10 единиц Сап I (New England Biolabs) был добавлен в течение 10 мин при 37 ° C. Бисер промывали 3 раза с 0,9 мл буфера, а затем ресуспендировали в 50 мкл буфера быстрого Т4 реакции лигирования (Новая Англия Биолабс). 2 мкл Быстрый лигазы Т4 (Новая Англия Биолабс) была добавлена ​​вместе с 6 нМ конечная концентрация предварительно отожженных раздвоенной ДНК (RP10, RP22, RP25) в течение 10 мин при комнатной температуре. Бисер промывали 3 раза с 0,9 мл буфера А. 5. Ассамблея replisome и начало синтеза ведущей нити на вилке репликации была выполнена следующим образом: 448 пмоль DnaB (как гексамера) инкубировали с бисером 150 мкл буфера (20 мМ Трис-Cl (рН 7,5), 8 мМ MgCl 2, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT, 10% глицерина) в течение 30 с при 23 ° C. 4,9 пмоль Pol III * (Pol III HE минус β), 15 пмоль β, 2 мМ АТР и 60 мкМ каждого из дГТФ и дАТФ были добавлены в объеме 200 мкл и инкубировали еще 5 минут при температуре 37 ° C. Репликация было возбуждено по добавлением 10 мкг SSB и 24 мкМ каждого из дАТФ и dTTP вместе с [α-32 P] dTTP и [α-32 P] дЦТФ (специфическая активность, 3000-5000 копий в минуту / пмоль) до конечного объема 250 мкл. Реакции были прекращены через 10 мин после добавления 12 мкл 500 мМ ЭДТА. 6. Очистка и концентрация радиоактивной меткой продукция ДНК осуществляется следующим образом: Шариков (сверху) варили после реакции было прекращено, чтобы удалить ДНК из бисера. Любой остаточной ДНК остаются прикрепленными к бисером удаляли лечения бисер с протеиназы К в объеме 10 мкл в течение 30 мин при 50 ° C. Затем шарики вареных и супернатант удаляли магнитной сепарации. Комбинированный супернатант, содержащий ДНК очищали с использованием ПЦР Qiagen Очистка комплект. Очищенная с радиоактивной меткой продукты ДНК были затем проанализированы в щелочном агарозном геле. * Репликации в отсутствие лобового РНКП остановился удлинение комплекса было выполнено, что и выше, однако, σ 70 был опущен. Представитель Результаты: Столкновение replisome с лобового РНКП обычно приводит двух продуктов в 2,5 кб и 3,6 кб в длину. 2,5 кб продукт представляет длина ДНК из вилки остановился РНКП и результаты replisome сваливания при столкновении с РНКП. 3,6 кб продукта представляют полнометражный ДНК и результатов либо неполной занятости из промотора РНКП или частичное replisome чтения через головы-на РНКП. Хорошее или точный результат показывает, что примерно 50% от полной длины ДНК производится. Тем не менее, в некоторых случаях меньше занятость промотора РНКП происходит, и более высокий процент полнометражный ДНК наблюдается с большим населением replisomes не сталкиваются в лоб РНКП. Репликация в отсутствие остановился РНКП результаты только в полнометражных ДНК (3,6 кб). Рис. 1 replisome мешает лобовое РНКП. (А) экспериментальной установки. E. ColРНКП я остановился удлинение комплекса была собрана на биотинилированного ДНК, содержащей T7A1 промоутер, как описано выше (9). Короче говоря, остановить удлинение комплекса была сформирована 20 бит вниз по течению от промоутера путем инкубации РНКП холофермента с биотинилированного ДНК в течение 10 мин с последующим добавлением в ВСУ, ГТФ, АТФ и CTP в течение еще 10 мин. Стрептавидином шарики добавлены дополнительные 10 минут, затем бисер промывали пять раз с 0,9 мл буфера, содержащего 0,75 NaCl, 200 мг / мл гепарина и 100 нМ однонитевые ДНК, чтобы удалить неустойчивой РНКП-ДНК и избыточную НПТ . ДНК затем переваривают SAPI, промывают, и лигировали с предварительно отожженных раздвоенной ДНК. Бисер промывали вновь до сборки replisome. Промоутер находится в 2,5 кб из вилки и ориентирована на прямую транскрипцию к вилке. (B) DnaB был добавлен затем replisome был собран и репликации был инициирован либо в присутствии (дорожка 2) или отсутствие (дорожка 1), лобового РНКП.