Directe Start van een replicatievork vast door een Head-On RNA polymerase

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Pomerantz en O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010) . 1. Montage van een stil RNAP rek complex werd als volgt uitgevoerd: 500 nM uiteindelijke concentratie van E. coli RNAP σ 70 HE werd gemengd met 5 nM uiteindelijke concentratie van een gebiotinyleerd 3,6 kb DNA-template met daarin de T7A1 promoter in 100 ul buffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) gedurende 10 min bij 37 ° C. 100 pM van de APU en 40 uM elk van GTP, ATP, en CTP werden toegevoegd voor een extra 10 min bij 37 ° C. 2. Immobilisatie van het gestopt RNAP rek complex op streptavidine parels werd als volgt uitgevoerd: 200 ul van streptavidine magnetische gecoate kralen (Invitrogen) werden toegevoegd aan de reactie hierboven voor 10 min bij kamertemperatuur. 3. Zuivering van het geïmmobiliseerde gestopt RNAP rek complex werd als volgt uitgevoerd: De kralen (van boven) werden gewassen 5 keer met 0,9 ml buffer A met 0,75 M NaCl, 200 ug / ml heparine en 20 microgram / ml ssDNA (Het supernatant werd verwijderd na elke wasbeurt stap voor magnetische scheiding.) Vervolgens wordt het bolletjes werden gewassen 2 keer met 0,9 ml buffer A. 4. Vorming van een replicatie vork stroomafwaarts ten opzichte van de kop-op RNAP werd als volgt uitgevoerd: De kralen (van boven) werden geresuspendeerd in 100 pi van de New England Biolabs buffer 4 en 10 eenheden van Sap I (New England Biolabs) werd toegevoegd gedurende 10 min bij 37 ° C. De kralen werden 3 maal gewassen met 0,9 ml buffer A en vervolgens geresuspendeerd in 50 ui van Quick T4 ligatiereactie buffer (New England Biolabs). 2 pi van Quick T4 ligase (New England Biolabs) werd toegevoegd, samen met 6 nM uiteindelijke concentratie van de pre-gegloeid gevorkte DNA (RP10, RP22, RP25) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De kralen werden 3 maal gewassen met 0,9 ml buffer A. 5. Vergadering van de replisome en de inleiding van de leidende streng synthese bij de replicatie vork werd als volgt uitgevoerd: 448 pmol van DnaB (zoals hexameer) werd geïncubeerd met de kralen 150 ul buffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) gedurende 30 s bij 23 ° C. 4,9 pmol van Pol III * (Pol III HE minus β), 15 pmol van β, 2 mM ATP, en 60 uM elk van dGTP en dATP werden toegevoegd tot een volume van 200 ul en geïncubeerd nog eens 5 min op 37 ° C. Replicatie werd gestart op het toevoegen van 10 microgram SSB en 24 pM elk van dATP en dTTP, samen met [α-32 P] dTTP en [α-32 P] dCTP (specifieke activiteit, 3,000-5,000 cpm / pmol) tot een eindvolume van 250 pi. Reacties waren beëindigd na 10 min op het toevoegen van 12 pi van 500 mM EDTA. 6. Zuivering en concentratie van de radio-gelabelde DNA-producten werd als volgt uitgevoerd: De kralen (van boven) werden gekookt na de reactie werd beëindigd om het DNA te verwijderen uit de kralen. Eventueel resterende DNA dat aan de kralen werd verwijderd door de behandeling van de korrels met proteinase K in een volume van 10 ul gedurende 30 minuten bij 50 ° C. De parels werden dan gekookt en het supernatant werd verwijderd door middel van magnetische scheiding. De gecombineerde supernatant met het DNA werd gezuiverd met behulp van de PCR Qiagen Cleanup kit. Gezuiverd radio-gelabelde DNA-producten werden vervolgens geanalyseerd in een alkalisch agarose gel. * Replicatie in de afwezigheid van een head-on RNAP gestopt verlenging complex werd uitgevoerd zoals hierboven, echter, σ 70 werd weggelaten. Representatieve resultaten: Botsing van de replisome met een kop-on RNAP resulteert meestal in twee producten van 2,5 kb en 3,6 kb in lengte. Het 2,5 kb product vertegenwoordigt de lengte van het DNA van de vork aan de RNAP gestopt en de resultaten van replisome stalling bij botsing met de RNAP. Het 3,6 kb product vertegenwoordigen full-length DNA en de resultaten van beide onvolledige bezetting van de promotor door RNAP of gedeeltelijke replisome lezen-through van het hoofd-on RNAP. Een goede of een nauwkeurig resultaat toont aan dat ongeveer 50% full-length DNA wordt geproduceerd. Echter, in sommige gevallen minder bezetting van de promotor door RNAP optreedt en een hoger percentage van de volledige lengte DNA wordt waargenomen, omdat een grotere bevolking van replisomes niet geconfronteerd met een head-on RNAP. Replicatie in de afwezigheid van een stilstand RNAP resulteert in enige full-length DNA (3,6 kb). Figuur. 1 De replisome is belemmerd door een head-on RNAP. (A) Experimentele opstelling. Een E. coli RNAP gestopt rek complex was gemonteerd op een gebiotinyleerde DNA dat de T7A1 promoter zoals eerder beschreven (9). In het kort, was een stil rek complex gevormd 20 basispunten stroomafwaarts van de promoter door incuberen RNAP holoenzyme met gebiotinyleerd DNA gedurende 10 minuten, gevolgd door de toevoeging van Apu, GTP, ATP, en CTP voor nog eens 10 minuten. Streptavidine kralen werden toegevoegd voor een extra 10 minuten toen de bolletjes werden vijf keer gewassen met elk 0,9 ml van de buffer die 0,75 NaCl, 200 mg / ml heparine, en 100 nM enkelstrengs DNA tot instabiele RNAP-DNA complexen en overtollige NTP's te verwijderen . Het DNA werd vervolgens gedigereerd met Sapi, gewassen, en geligeerd aan een pre-uitgegloeid gevorkte DNA. De kralen werden weer voor gewassen om de montage van de replisome. De promotor ligt op 2,5 kb van de vork en is gericht op directe transcriptie de richting van de vork. (B) DnaB werd toegevoegd toen de replisome werd samengesteld en replicatie werd ofwel ingewijd in de aanwezigheid (laan 2) of afwezigheid (baan 1) van een head-on RNAP.