באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

1. חלבון לדוגמא הכנה בתוך צינור 500 microfuge μl, לשלב את הפעולות הבאות: מגיב כרך להוסיף: * חלבון המדגם (עד 1 מ"ג) עד 112 μL מאגר דוגמאות (5X) המסופק בערכה מחסנית 30 μL DTT 1M 8μL 18 Ω H 2 O x μL לסך של נפח דגימה של 150μL ** לפגל דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר. * הכמות הכוללת של חלבון להיפרד יהיה תלוי במורכבות של המדגם. לקבלת דוגמאות מורכבות יותר, כגון homogenate רקמות, 150-200 מיקרוגרם לערוץ מומלץ. ** אם היקף המדגם הוא פחות מ 112 μL, להוסיף 18 Ω H 2 O להביא את נפח הסופי μL 150. 2. טוען מחסנית GELFREE הסר את מחסנית GELFREE 8100 משקיק את נייר הכסף. הסר להתעלמות אוטם צלחת. הסר את חוצץ אחסון מן התאים מחסנית באמצעות פיפטה. אם כל 8 חדרי מחסנית ישמשו, מחסנית יכול להיות הפוך כדי לרוקן את מאגר אחסון של התאים. הכן את מחסנית לטעינת ידי הוספת מאגר ריצה GELFREE לכל אחד מתאי מחסנית כדלקמן: GELFREE דיו הקאמרית נפח הצפת GELFREE ריצה להוסיף חיץ האנודה המאגר 8 מ"ל קטודה מאגר חיץ 6 מ"ל אוסף לתאי 100 μL כל הסר וזורקים כל חיץ מן החדר טעינת המדגם. טען את 150 דגימות μL לתאי טעינה באמצעות pipettor 8 ערוצים. הנח את מחסנית נטען לתוך תחנת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה. מנמיכים את מערכי אלקטרודות ולסגור את המכסה. 3. ריצה את מחסנית באמצעות התצוגה של מכשיר מסך מגע, לחצו על לחצן שיטה להציג את רשימת מתוכנתים מראש שיטות. כל אחד מתוכנתים מראש שיטות מורכב מתח להגדיר זמן מבוססי הפסקות שנועדו לפתור חלבונים בתוך טווח מסוים של משקל מולקולרי. 8100 GELFREE להשהות באופן אוטומטי לאיסוף חלק במרווחים המפורטים השיטה. לאחר בשיטה המתאימה זוהה, לחצו על לחצן לאחזר, והזן את המספר של השיטה מתוכנתים מראש הרצוי באמצעות לוח המקשים על המסך. לחץ על OK, ולאחר מכן לחצו על כפתור להחיל. השיטה יושמה יופיע בתחתית המסך הראשי. כדי לבחור את הערוצים (מספר דוגמאות) אשר ישמשו בטווח, לחצו על לחצן הערוץ על המסך הראשי. כדי לבחור את כל שמונה ערוצים, לחץ על בחר הכל. לאחר מכן, הקש לעשות כדי לחזור למסך הראשי. ודא מכסה בטיחות סגור כי נורית החיווי הירוקה בחלק התחתון של המסך. כדי להתחיל את ההפרדה לחלבון, לחצו להתחיל. תחנת ההיפוך חלוקה אוטומטית הפסקה כאשר הגיע הזמן לאסוף את השברים. הערה: כאשר המערכת פועלת, חוגי מוצגים בתיבה בצד שמאל של המסך לתאר את המצב של כל ערוץ. עיגול ירוק עולה כי הערוץ הוא פעיל, עיגול צהוב עולה כי המכשיר כבר עצר, עיגול אדום עולה כי הערוץ נכשל. מתח להחיל וזרמים מוצגים בצד ימין של החוגים מצב הערוץ. שברים צריך רק להיות מוסר כאשר החוגים מעמד הפכו צהוב התראת הטקסט מופיע על המסך של המכשיר. כדי להסיר שברים, לפתוח את המכסה של המכשיר ולהשתמש ערוץ 8-פיפטה לסגת 150 μL מכל אחד לתאי האיסוף. לאחר שברים הוסרו, לשטוף את קאמרית אוסף כפול עם הצפת ריצה GELFREE ידי הוספת 100 μl לערוץ ו pipetting למעלה ולמטה פעמיים. לאחר כביסה, להוסיף 100uL של GELFREE ריצה הצפת בחזרה לתאי איסוף, לסגור את המכסה, ולחץ על כפתור לחדש. GELFREE 8100 תוצג עד ההפסקה בפעם הבאה. הזמן הכולל שנותרו הניסוי מוצג בצד ימין של המסך. כדי לעבור בין הזמן שנותר, הזמן שחלף, זמן הפסקה, לחצו על לחצן מעל תיבת הצגת זמן. לאחר שכל החלקים כבר שותףllected, הם יכולים מיד לשמש להכנת במורד נוספים, כגון התמקדות isoelectric או ג'ל אלקטרופורזה, או לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה או immunoaffinity. 4. נציג תוצאות 200 מיקרוגרם של homogenate הכבד שור חולקה 12 שברים בכל, באמצעות מערכת ההיפוך חלוקה GELFREE. 6 μL של כל חלק היה להריץ על ג'ל SDS סטנדרטית לעמוד 1D ומוכתמת כסף. כפי שניתן לראות בתרשים 1, המדגם היה חלבון מופרדים לתוך 12 שברים ברורים, פורש את טווח משקל מולקולרי של 3.5kDa כדי 150kDa. תקן משקל מולקולרי (ColorBurst, Sigma) מוצגים גם מסלולים 1 ו – 14. ג'ל המוצג כאן מדגיש את קצב התאוששות גבוהה מושגת באמצעות מערכת GELFREE 8100 עבור חלוקה חלבון. ג'ל המוצג כאן מייצג 4% של החלבון התאושש 200 מיקרוגרם. באיור 1. חלבונים מהכבד שור homogenate מופרדים באמצעות מערכת ההיפוך חלוקה GELFREE. 6 μL של כל חלק 150 μL היה טעון לרוץ על ג'ל SDS 1D דף מוכתם כסף. תקן מולקולרית (MW) משקל היה טעון גם כמצוין. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.