동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

그림 1. papain과 cystatin B 단지 (파란색) (노란색)의 3 차원 구조. 변이된 cystatin B 급 잔류물은 빨간색으로 표시됩니다. 1. Biacore 시스템을 사용하여 레이블이없는 상호 작용 분석의 원칙 Biacore 시스템을 사용하는 전형적인 레이블이없는 구속력이 실험에서는, 생분자은 '리간드가'센서 칩의 표면에 첨부되어 칭했다. 흐름 – 채널 시스템은 검색이 이루어지는 칩 표면 접촉에 'analyte'을 칭했다는 바인딩 파트너를, 제공합니다. analyte는 리간드에 바인딩하면 표면에서 질량을 축적의 결과 변화는 표면 plasmon 공명 (SPR)에 의해 감지됩니다. SPR 응답은 바인딩 analyte의 금액에 비례합니다. 바인딩이 실시간으로 측정되기 때문에, 운동 협회와 특정 상호 작용에 대한 해리 속도 상수가 결정하실 수 있습니다. 이 상수에서, 그것은 평형 분리가 상수로 친화력을 계산하는 것이 가능합니다. 그것은 안정된 상태 데이터 바인딩에서 친화력을 계산하는 것도 가능합니다. 유사한 방법론도 구체적으로 표면에 리간드에 바인딩 단백질의 농도를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 2. 단백질 – 단백질 상호 작용의 운동 특성을 분석 Biacore의 X100에는 운동 분석 단일 사이클 속도론을 사용하여 수행할 수 있습니다. 단일 사이클 속도론 실험에서 analyte의 농도 시리즈는 주사 사이에 표면을 재생하지 않고 하나의 분석주기에 주입합니다. 그것이 적합한 재생 조건을 찾기 어려운 경우 따라서, 단일 사이클 속도론은 운동 분석을 수 있습니다. 운동의 실험을위한 데이터가 수집되면, Biacore의 X100 평가 소프트웨어는 상호 작용 모델 데이터를 피팅하여 K, K D 및 K D의 값을 생성합니다. 3. 단백질 농도를 결정하는 방법 biomolecules 사이의 상호 작용을 분석하는 것은 자신의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 핵산을 다른 단백질로 단백질의 바인딩을 특성화하고, 작은 분자로하는 생화 학적 연구의 기초이며, 약물 발견을 포함하여 다른 많은 분야에서 사용을 찾습니다. 이 상호 작용하는 단백질 간의 상호 작용 반응 속도론의 정확한 측정을 위해 그것은 analyte로 사용되는 실험 예제에서 구체적으로 바인딩 단백질의 농도를 알고하는 것이 필수적입니다. 280과 같은 colorimetric assays의 분광 광도계 읽기는 브래드 포드의 시약을 고용 하나는 일반적으로 총 단백질 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 그러나, 단백질 불순물이 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 더 중요한 것은, 단백질 모두 활성 및 비활성 양식은 총 단백질 농도에 포함되어 있습니다. 특히 잘못된 접힘으로 인해 활성화되지 않을 수 있습니다 재조합 단백질의 경우, 그것은 샘플에서 구체적으로 바인딩 단백질의 비율을 결정하는 것이 중요합니다. Biacore의 X100에서 특정 바인딩 활동에 관련된 농도는 중 알려진 표준에서, 또는 더 최근에 소개된 방법론 교정 – 무료 농도 분석 (CFCA)를 사용하여 파생 교정 곡선에 바인딩 응답 수준 비교에 의해 결정하실 수 있습니다. CFCA은 표준에 의존하지 않습니다. 따라서, CFCA 표준은 보통 사용할 수없는 단백질의 돌연변이 형태를 연구의 경우에 특히 유용합니다. 칩 표면에 시료의 확산은 속도 – 제한 때 CFCA 실험에서 초기 바인딩 속도 조건 하에서 서로 다른 유량에서 측정됩니다. 초기 바인딩 속도 1,2에서 특정 바인딩 농도를 계산할 때 analyte의 확산 계수는 흐름 전지와 흐름 속도의 크기는 고려하고 있습니다. 동력학 실험에서 analyte의 농도는 운동 협회 속도 상수와 실험 데이터의 친화력의 계산에 사용됩니다. CFCA 및 Biacore 시스템의 운동 측정은 모두 같은 상호 작용의 속성에 의존하고 있습니다. 따라서 Biacore 분석에 의해 결정 특정 바인딩을 농도가 아닌 총 단백질 농도를 사용하면 결과의 신뢰성을 증가시킵니다. 4. Cystatin B와 Papain 간의 상호 작용을 특징으로 Biacore 분석을 사용 포유 동물 cystatin B는이 단백질은 주로 nons에 참여 papain과 같은 시스테인 proteinases, 주로 카텝신 B, H, K, L 및 S.의 가역, 경쟁 꽉 바인딩 단백질 억제제이다선택 세포내 단백질 저하. Cystatins는이 효소에 의해 부적 절한 proteolysis의 세포와 조직을 보호하기 위해 추정하고 있습니다. 그들은 또한 기생충과 바이러스로부터 시스테인 proteinases를 inactivate와 같은 전염성 대리인의 침략에 대항하는 방어에 참여할 수 있습니다. 또한, cystatins 자주 구조 기능 연구의 모델 효소로 사용되는 등 papain과 같은 몇 가지 식물 시스테인 proteinases을, 억제. 두 단백질 사이의 상호 작용이 억제 측면에서 N – 및 C – 말단까지 두 헤어핀 루프에 의해 제공됩니다, 소수성 연락처에 의해 지배되어 papain 3 보여줍니다과 cystatin의 B 복합의 입체 구조 ( 그림 1). 본 연구에서는, 우리는 소 cystatin를 사용하여 papain에 바인딩을위한 C – 터미널 종료하고 cystatin B의 두 번째 바인딩 루프의 중요성을 검토 papain과 상호 작용 분야에 포인트 변이를 포함하는 B 변종. 우리는 특정 바인딩을 사용하는 네 개의 cystatin의 B 변종의 농도뿐만 아니라 야생의 종류 단백질의 처음으로 결정합니다. 활성 cystatin B의 특정 바인딩 농도가 결정되면, 야생 입력하고 papain에 바인딩 cystatin B의 돌연변이 변종의 속도와 친화력 상수 Biacore X100를 사용하여 측정하고 있습니다. 5. 악기 및 시약 cystatin의 B 변종은 Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala 및 Cys3Ser는 등 이전 4 설명한 생산됩니다. 모든 뮤턴트 cystatin B.의 체인이 황을 통해 연결된 비활성 dimers의 형성을 방지하기 위해, 위치 3 세린에 시스테인의 추가 대체를 포함하는 이전 5 설명된대로 papain 대상도 준비가되어 있습니다. 이것은 S – (methylthio) catalytically 비활성 프로 테아제를 렌더링 활성 클레 프트에 Cys25에 연결된 methylthio 그룹을 가지고 papain (MMTS – papain). Biacore의 X100 플러스 패키지 Biacore의 X100은 특정 바인딩 농도 및 바인딩 속도론을 측정하고 분석하는 데 사용됩니다. MMTS – papain은 Biacore 아민 커플링 키트를 사용하여 센서 칩 CM5에 고정됩니다. 실행은 25 ° C에서 수행하고, 버퍼 산도 7.4에서 0.01 M의 Hepes, 0.15 M NaCl, 0.0034 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 0.05 %의 폴리 솔 베이트 20입니다. cystatin B의 각 변종 사이에 센서의 표면은 10 μl / 분 유동 속도로 30 초 동안 20 밀리미터 NaOH로 재생됩니다. 리간드 MMTS – papain의 6.Immobilization CFCA 분석을 위해 MMTS – papain의 공유 결합 첨부 파일 CFCA는 속도가 표면에 analyte 분자의 확산 (대량 전송 제한)에 의해 제한 조건에서 구속 률의 측정에 의존하고 있습니다. 이것은 리간드의 높은 고정 수준으로 선호합니다. MMTS – papain의 고정이 설정하고 Biacore의 X100 제어 소프트웨어의 고정 마법사를 사용하여 실행되었습니다. 10 μl / 분 유량 7 분 succinimide (NHS)와 carbodiimide (EDC)의 혼합물의 주입에 의한 유동 세포 2의 표면을 활성화합니다. 흐름 세포 1 참조 표면으로 사용하기 위해 수정되지 않은 남아 있습니다. 5 μl / 분 유량에서 15 분 동안 산도 4.5에서 아세트산 나트륨 버퍼에 50μg/ml에서 MMTS – papain을 주사. Ethanolamine 10 μl / 남은 활성 에스테르를 비활성화 분의 유량 7 분 동안 주입됩니다. 전체 커플링 절차에 따라서해야 ~ 유동 셀 2 고정화 3000 RU MMTS – papain. 운동 분석을 위해 MMTS – papain의 공유 결합 첨부 파일 동일한 절차는 유일한 차이점은 운동 분석, 고정 레​​벨이 확산에 의해 제한되는 바인딩 속도를 피하기 위해 낮은해야되는되는, 운동 분석을 위해 MMTS – papain을 immobilizing에 사용됩니다. 흐름 세포 1 참조 표면으로 사용하기 위해뿐만 아니라이 단계에서 수정되지 않은 남아 있습니다. 7.1에서와 같이 NHS과 EDC의 혼합물로 표면의 활성화 후, MMTS – papain은 50 초 동안 1μg/ml에 주입합니다. 그 후 표면이 단계에서 7.3로 ethanolamine의 주사로 드 활성화됩니다. 커플링 수준은이 절차 후 약 50 RU해야합니다. 7. CFCA 분석을 사용하여 결정 Cystatin B의 농도 CFCA 실험은 Biacore의 X100 플러스 패키지에 CFCA 마법사에 따라 설정됩니다. 약 10 NM 단백질은 유량 10 100 μl / 48초에 대한 중복의 분 주입니다. 표면은 각주기 사이에 20 밀리미터 NaOH로 재생됩니다. 각각의 유량에 대한 빈 주사를 포함합니다. 단백질 농도는 다음 일을 사용하여 데이터 바인딩 (그림 3)에서 결정됩니다Biacore의 X100 플러스 패키지 평가 소프트웨어의 E CFCA 평가 있습니다. 그림 2. 야생 형 cystatin의 B. 특정 바인딩 농도 데이터의 CFCA 분석의 결과는 10 및 100 μl / 분의 흐름 속도에서 얻은 sensorgrams에서 추출한했다. 돌연변이의 그림 3. 농도는 280 측정 (N = 3) 및 CFCA (N = 2)을 사용하여 결정됩니다. 표준 오류는 오류 막대으로 표시됩니다. 어금니 흡수 계수는로 (6)에 설명된 계산했다. 두 가지 방법에 의해 결정 Cys3Ser/Leu73Gly 돌연변이의 농도 값에 큰 차이는 볼 수 있습니다. CFCA하여 해당과 280 측정에 의해 결정 농도를 비교하면, 그것은 대부분의 경우 단백질이 Cys3Ser/Leu73Gly 변종에 대해, 완전히 활성화되어있는 동안, 활성 단백질의 분율은 (그림 3) 매우 낮은, 그 분명하다. 아래 표는 280로 전체 농도에 관한 cystatin의 B 변종의 활동을 보여줍니다. 견본 280 (%)과 관련 CFCA 와일드 유형 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83 8. Papain에 바인딩 Cystatin B의 속도론을 측정 CFCA 측정을 바탕으로, 2.5에서 cystatin의 B 변종의 각 40 NM에 이르기까지 두 배 농도 시리즈를 준비합니다. 동력학 실험은 단일 사이클 접근 방식 Biacore의 X100에 반응 속도론 마법사를 사용하여 설정됩니다. 표면은 주사 사이에 생성하지만, 각각의 분석 사이클이 끝난 후 재생 솔루션으로 20 MM NaOH를 사용하지 않습니다. 샘플을 포함하는 각각의 사이클이 버퍼 대신 시료의 주입 빈 사이클에 의해 둘러싸인되도록 실험을 설정합니다. 자동으로 참조의 빈 subtractions을 수행하는 Biacore의 X100의 반응 속도론 평가 기능을 사용 1:1 상호 작용 모델을 피팅하기 전에 데이터를 빼서. papain으로 cystatin의 B 변종의 바인딩을위한 얻은 실험 데이터는 그림 4에 표시됩니다. 아래 테이블은 협회와 해리 속도 상수와 운동 분석에서 얻은 평형 분리 상수를 각각 요약하여 보여줍니다. 견본 K (M -1 S -1) K D (S -1) K D (M) 와일드 유형 1.8 X 10 6 0.41 × 10 -3 2.3 × 10 -10 Cys3Ser/His75Gly 1.1 X 10 6 1.7 × 10 -3 1.5 × 10 -9 Cys3Ser/Leu73Gly 1.1 X 10 6 23 × 10 -3 2.2 × 10 -8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1.7 X 10 6 12 × 10 -3 7.1 × 10 -9 Cys3Ser 0.9 X 10 6 0.53 × 10 -3 5.8 × 10 -10 그림 4. MMTS – papain에 바인딩 cystatin의 B 변종에 대한 운동 프로파일은 하나의 사이클 속도론을 사용하여 결정됩니다. Sensorgrams는 빈과 표시 기준에 검정 중첩 1시 1분 상호 작용 모델에 맞는 운동 데이터를 빼서. 돌연변이의 연결 속도가 야생 유형 단백질 (그림 5, 상단 패널)의 비교되지만, 돌연변이의 해리 속도 상수는 평형 분리에 상응하는 증가와 규모의 가까이에 2 인분으로 높은 수 상수 (그림 5, 낮은 패널). 그림 5. 속도와 친화력 상수의 계산은 CFCA에서 얻은 농도에 따라되었습니다. 변이와 연관된 K, K D 및 K D의 변화는 그래프에 묘사된 있습니다. 샘플 농도는 실험 데이터에서 일정한 협회 속도의 계산에서 매개 변수이기 때문에, 그것은그것이 올바른 것이 중요합니다. 대신 CFCA의 280 측정에 따라 농도를 사용하면 Leu73 교체가 다른 cystatin의 B 변종보다 시간이 약 10 느린 협회에서 결과로 보인다 협회 속도에 대한 중요하다는 것을 결론으로 이어질 것입니다. 그러나, CFCA에 의해 측정 특정 바인딩 농도는이 경우에는 전체 단백질의 약 10 %입니다. 이것이 계정에 이것을 당하였을 때 그것은 Leu73 협회의 속도가 다른 변종의와 유사한 것이 분명해진다. 따라서, CFCA 따라서 상호 작용 메커니즘의 적절한 해석이 가능하기 K와 K D의 정확한 평가를 위해 수 있습니다.