Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

I. Voorbereiding voor injectie Deze sectie beschrijft de voorbereidende stappen die moeten vooraf worden genomen om te injecteren cDNA in de kern van neuronen. De isolatie procedure voor neuronen valt buiten het bestek van dit artikel, maar het is belangrijk om neuronen gescheiden in individuele cellen hebben en hechten goed aan de onderkant van 35 mm celkweek gerechten (zie Overleg voor nuttige tips om dit te bereiken). Hoewel een verscheidenheid van verschillende neuronen zou kunnen worden gebruikt, zijn perifere ganglia, zoals de superieure cervicale ganglia (SCG) of de achterwortelganglia voorkeur voor dissectie, omdat ze gemakkelijk toegankelijk zijn en de opbrengst van een groot aantal neuronen. Bijkomende voordelen van het gebruik van SCG neuronen zijn dat ze een relatief homogene populatie van cellen en goed gekarakteriseerde 1,2,3,4. A. Bereiding van plasmide cDNA voor injectie Om te voorkomen dat verontreiniging of afbraak van DNA, moeten handschoenen worden gedragen tijdens de voorbereiding. DNA dat codeert voor het eiwit van belang is gesubkloneerd in een geschikte expressievector zoogdier, zoals PCI (Promega, Madison, WI), onder de regulering van de zeer en de constitutief actieve cytomegalovirus (CMV) promotor. Als het eiwit niet wordt gelabeld, een reporter plasmide, is codering EGFP bijvoorbeeld (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), co-geïnjecteerd om succesvolle injectie en expressie te bevestigen. DNA wordt geïsoleerd met behulp van een hoge kwaliteit scheidingskolom (bijv. QIAfilter Midi-prep-kit, Qiagen, Chatsworth, CA) en verder gezuiverd met behulp van een centrifugale filter unit met een PVDF filter (0,1 urn, Millipore, Bedford, MA) om deeltjes te verwijderen in de plasmide voorbereiding, die injectie pipetten kunnen een belemmering vormen tijdens de injectie proces. Plasmiden worden bewaard bij -20 ° C bij een concentratie van ongeveer 1 ug / ul in een geschikte DNA opslagbuffer (bijv. TE-buffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Onmiddellijk voorafgaand aan de micro-injectie, zijn plasmide cDNAs verdund en gemengd om de gewenste uiteindelijke concentratie in TE-buffer of H 2 O. Typisch, 5-10 ng / ul van het reportergen is voldoende om geïnjecteerde cellen label, en de totale concentratie van cDNA te worden geïnjecteerd mag niet meer dan 200 ng / ul, omdat DNA is viskeus bij hoge concentraties en kunnen verstoppen injectie pipetten. Een klein volume van het cDNA voor injectie (5-10 pi) wordt bereid door het mengen van druppels van de oplossing op de schone oppervlak van een klein stukje van Parafilm (zijkant onder de papieren achterkant). Meng de druppels van de oplossing door pipetteren op en neer meerdere malen met een pipetor en voorkomen dat er luchtbellen tijdens het mixen. Met behulp van een pipet microloader tip (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), overdracht van het cDNA oplossing voor een speciaal geprepareerde hematocriet buis (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Zie materialen sectie voor instructies over het bereiden hematocriet buizen (Materialen tabel). Plaats de hematocriet buis met de cDNA injectie oplossing in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer de buis voor 15-30 minuten bij 10 000 g in een microcentrifuge is uitgerust met een vaste hoek of swingende emmer rotor (Eppendorf), bij kamertemperatuur (20-24 ° C) om sediment deeltjes in de cDNA oplossing die kan blokkeren de micro-injectie pipet. De cDNA-oplossing voor injectie kan worden bewaard bij kamertemperatuur tijdens de injectie sessie. B. Fabricatie van injectie pipetten Wegwerp glazen micro-injectie pipetten zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. Femtotips, Eppendorf), die zijn handig, maar duur (10 dollar per micro-injectie pipet). Injectie pipetten kunnen worden vervaardigd in het laboratorium met behulp van een programmeerbare P-97 Flaming Brown pipet trekker (Sutter Instrument Company, Novato, CA) en filamented, dunwandige borosilicaatglas capillaire buisjes (World precisie-instrumenten, Sarasota, FL). Deze optie is meer kosteneffectief en zorgt voor de controle van micro-injectie pipet vorm en grootte. Een twee-fase programma wordt gebruikt om smalle microinjectie pipetpunten trekken. Sinds de opening van de micro-injectie pipetten te smal is om te onderzoeken onder een lichtmicroscoop, de kwaliteit van de injectie pipetten moeten direct worden geëvalueerd door het injecteren van een paar cellen voor de programma-instellingen zijn afgerond. De volgende instellingen zijn bij benadering voor warmte, trek, snelheid en tijd instellingen: (pull 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Deze instellingen variëren met verschillende batches van glas en door de toestand van de verwarming filament in de trekker, en dient te worden aangepast zoveel als nodig. Voor meer details zie 5. Trek een aantal (2-5) injectie pipetten per schotel van neuronen te worden geïnjecteerd, in geval van schade of problemen tijdens de injectie sessie. Bewaar injectie pipetten in een afgedekte container om stof te voorkomen dat de micro-injectie pipet tip. II. Intranucleaire micro-injectie tent "> Dit hoofdstuk beschrijft het proces van het injecteren van cDNA in de kern van neuronen. Een eenvoudige micro-injectie set-up bestaat uit een omgekeerde fase-contrast microscoop (bijv. Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) om het proces te visualiseren, micromanipulator (bijv. Eppendorf 5171) om de beweging van de injectie pipet en een druk injector (bijv. Eppendorf FemtoJet Express) drukken om de cDNA-oplossing te verdrijven uit de pipet. aansluiten van de druk injector aan de micromanipulator zorgt voor de synchronisatie van de laatste twee processen tijdens injecties. Andere optioneel, maar wordt sterk aanbevolen, componenten zijn onder andere een gemonteerde video monitoring systeem (CCD-camera, Cohu Inc, San Diego, CA; zwart-wit video monitor, Sony Corporation, Tokio, Japan). Dit systeem is niet een absolute vereiste voor injecties; echter, de zwarte en witte monitor biedt een hoog contrast voor een betere visualisatie van de celkern en biedt een meer comfortabele kijkervaring tijdens lange injectie sessies. Daarnaast is een laptop computer met software om een ​​hand-held controller te bedienen kan worden gebruikt om semi- automatiseren van de injectie proces (zie Overleg voor details). Het ideale moment om SCG neuronen injecteren is 3-6 uur na de dissociatie. In dit stadium, de cellen zijn bolvormig, stevig bevestigd aan de bodem van de schaal, en de kern is duidelijk zichtbaar, onder een fase-contrast microscoop, als centrale ronde organel met een donkere membraan, met een enkele of meerdere nucleoli (Figuur 1A). Plaats een schotel van gedissocieerd neuronen in het midden van de microscoop podium. Stel het beeld scherp en het optimaliseren van de fase contrast optiek van de microscoop, zodat de kernen van neuronen zijn duidelijk zichtbaar. Pipetteer 2 pi cDNA bereide oplossing in een micro-injectie pipet met behulp van een pipet microloader tip. Vermijden, up oplossing in de buurt van de bodem van de hematocriet buis, omdat dit kan opwekken deeltjes die gevestigd tijdens het centrifugeren. De gloeidraad in de micro-injectie pipetten moet de steun bij het opstellen oplossing voor de tip, maar als kleine luchtbelletjes blijven bestaan, tik zachtjes tegen de zijkant van het glas om ze te verjagen. Steek de micro-injectie pipet in de capillaire houder van de druk injector en bevestig de houder aan de micromanipulator. De houder is vastgesteld op een hoek van 45 °. Laat de micro-injectie pipet in de schaal. Omdat de pipet komt het kweekmedium, is een meniscus gevormd die van invloed op de breking van licht en verlaagt de beeldkwaliteit van de neuronen. Te verlichten dit probleem, kan de fase-ring-toren enigszins worden gecompenseerd tot de kernen van neuronen zijn duidelijk weer zichtbaar. Enige druk injectie systemen hebben een "schone"-functie die maximale luchtdruk van de micro-injectie pipet tip voor een korte duur van toepassing. Gebruik deze functie om de pipet van puin te ruimen voor het begin en tijdens injecties als de tip verschijnt verstopt. Als verdreven vloeistof is niet zichtbaar op het scherm tijdens het gebruik van deze functie, te vervangen door een nieuwe injectie pipet. Midden van de micro-injectie pipet in het weergavevenster monitor en lijn de tip naast een neuron en in hetzelfde focal plane als de nucleolus. Stel deze positie als de lagere z-as limiet op de micromanipulator. Deze positie is de diepte van de micro-injectie pipet zal om verder te gaan tijdens de injecties. Nu de positie van de tip ongeveer 30 micrometer boven dit punt, zodat de micro-injectie pipet wist de top van de neuronen. Het "injecteren"-modus van een Eppendorf 5171 micromanipulator kan worden gedefinieerd met de volgende instellingen om intranucleaire injecties uit te voeren. Het injecteren functie is ingeschakeld, terwijl de spiesen functie is gebleven. Een diagonaal injectie pad (langs de x-en z-as) levert de minste hoeveelheid celbeschadiging, en dus ook de axiale modus moet worden gebruikt voor injecties. Een injectie snelheid van 300 um / s voldoende is, en synchroniseren drukopbouw als de micro-injectie pipet bereikt de set z-as te beperken. De druk injector regelt de hoeveelheid cDNA-oplossing geïnjecteerd in de kern. In de "automatische" injectie-modus, de levering van DNA is de tijd-gestuurd en op initiatief van de aangesloten micromanipulator. De injectie druk (Pi) moet worden ingesteld tussen 100 tot 200 hectopascal (hPa; 1 hPa ~ 0.015 psi); hogere injectiedruk niet verbeteren slagingspercentages of kwaliteit van de injecties en kunnen andere problemen geven met de micro-injectie pipet tip grootte of de DNA zuiverheid . Een injectie duur (TI) van 0,3 s en een vergoeding druk (Pc) van 30 hPa, die een constante positieve druk om de toegang van de afsluiter deeltjes uit het kweekmedium in de pipet te voorkomen tip levert, worden gebruikt. Plaats het neuron te worden geïnjecteerd onder het topje van de micro-injectie pipet met behulp van de microscoop van de xy-as stadium controle. Lijn het puntje van de pipet boven het midden van de kern door te focussen heen en weer tussen tHij tip en de nucleoli. Injecteer de kern door te drukken op de knop injecteren (op de micromanipulator). Voor de injectie stap worden de beweging van de micro-injectie pipet en de vrijlating van cDNA-oplossing gecontroleerd door de micromanipulator. Het is moeilijk om een ​​succesvolle intranucleaire injecties te bevestigen door het oog, maar de injectie van de relatief lage viscositeit cDNA-oplossing (in vergelijking met de viskeuze nucleaire milieu), vaak verschijnt als een witte pluim onder fase-contrast optica en kan gebruikt worden als een indicator van de injectie in de kern. Soms is de micro-injectie pipet niet doordringen in de kernmembraan en gewoon duwt de kern. Een tweede injectie poging op dezelfde positie kan leiden tot een succesvolle injectie van DNA in de kern. Zwelling van de cel is meestal een indicatie van onbedoelde cytoplasmatische injectie. Ook is het belangrijk nucleaire zwelling niet goed verdragen door de neuronen en meestal resulteert in celdood kort daarna, dus de inspuitdruk en de duur mag niet meer dan de aanbevolen waarden. Ga verder injecteren van neuronen door de herpositionering van de microscoop etappe naar de volgende neuron af te stemmen onder de micro-injectie pipet. Systematisch navigeren door de schotel op ongeveer 50 tot 100 kernen injecteren alvorens terug te keren de schotel van neuronen naar de incubator voor overnachting incubatie. Met succes geïnjecteerd neuronen kan worden geïdentificeerd van de volgende dag door expressie van het reportergen. III. Representatieve resultaten Figuur 1: Superior cervicale ganglion (SCG) neuronen. Fase contrast beeld van SCG neuronen 3 uur post-dissociatie (A). In dit stadium, de kern is duidelijk zichtbaar wat helpt uitlijning van de micro-injectie pipet tip. De kern verschijnt in het midden van de neuronen met een enkele (links) of meerdere (rechts) dark nucleoli. SCG neuronen 16 uur na de injectie van EGFP cDNA in de kern (B). Links, SCG neuronen bekeken onder fase-contrast verlichting. Rechts, epifluorescerende beeld van dezelfde neuronen met succesvolle injectie en de daaruit voortvloeiende EGFP expressie in een neuron. Witte schaal bar is 20 micrometer. Figuur 2: whole-cell opnames van stromen door middel van heteroloog tot expressie G-eiwit gekoppelde innerlijk herstellen van K + (GIRK) kanalen van SCG neuronen. GIRK stromen (I GIRK) werden opgeroepen door een 200 ms spanning helling -140 tot 40 mV van een bedrijf potentieel van -60 mV (inzet van A) na activatie van endogene α 2-receptoren door norepinefrine (NE, 10 uM) . Gesuperponeerd sporen zijn opnames van dezelfde neuron en vermeld voor (zwart) en na toepassing van een van beide NE alleen (blauw) of NE plus 10 mM Ba 2 + (rood). Onderbroken lijnen geven het huidige niveau nul. Voor het opnemen ik GIRK, het ingeperkte externe oplossing (in mm) 130 NaCl, KCl 5,4, 10 HEPES, 10 CaCl2, 0,8 MgCl 2, 15 glucose, sucrose 15 en 0,0003 TTX, op pH 7,4 met NaOH. De interne opname oplossing bevatte (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, een CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, en 0,3 Na 2 GTP, op pH 7,2 met KOH. Het gebrek aan stroom opgewekt door de spanning ramp in de aanwezigheid van NE in uninjected SCG neuronen (A) toont aan dat SCG neuronen niet drukken endogene GIRK kanalen. Succesvolle injectie van plasmide cDNA dat codeert voor een functioneel GIRK kanaal 11 geeft aanleiding tot grote stromen tijdens het voltage oprit bij blootstelling aan NE (B, links). Stromingen hebben de typische kenmerken van de stromen via GIRK kanalen: activering door een G-eiwit gekoppelde receptor agonist (NE), actieve rectificatie, en blokkeren van de stromen door de vermeende GIRK-blokker, Ba 2 + (B, rechts rood spoor). Open en gevulde cirkels vertegenwoordigen ik GIRK op het bedrijf en de piekstroom respectievelijk. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.