تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent

1. إعادة برمجة BJ خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من 1 × 5 10 خلايا لكل بئر من لوحة 6 – جيدا. ثقافة الخلايا في 2 مل من وسط النمو (450 مل EMEM تستكمل مع 50 مل FBS ES المؤهلين ، 5 مل 10 ملي غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين ، 5 مل 200 ملي L – الجلوتامين و 0.9 مل β ملي 55 – المركابتويثانول) بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. في نفس اليوم ، البدء في إعداد لوحات التغذية MEF بإضافة 0.1 ٪ الجيلاتين المخفف في الماء لوحة 6 جيدا وتفرخ بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. بعد مرور فترة الحضانة ، وإزالة الخلايا متوسطة من BJ والمتوسطة النمو إضافة 2 مل تستكمل مع 6 ميكروغرام / مل من polybrene ، 500 ميكرولتر hOct4 – الفيروسة البطيئة ، 50 ميكرولتر hSox2 – الفيروسة البطيئة ، 50 ميكرولتر hNanog الفيروسة البطيئة ، و 50 ميكرولتر hLin28 الفيروسة البطيئة إلى كل بئر . صخرة بلطف لوحة لضمان وجود طلاء حتى من المتوسط. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. في اليوم نفسه ، وإزالة 1 قارورة من الخلايا MEF CF – 1 من النيتروجين السائل وذوبان الجليد. إزالة السائل من الآبار المغلفة الجيلاتين (انظر الخطوة 1.2) وإضافة الخلايا المغذية MEF في مناطق ذات كثافة تبلغ 0.2 X الخلايا 5 10 / أيضا. ينبغي أن الحجم الإجمالي للبئر الواحد يكون 2ml من الخلايا في النمو المتوسطة MEF (450 مل DMEM تستكمل مع FBS 50 مل و 5 مل غير الأحماض الأمينية الأساسية). في اليوم التالي ، مع فصل الخلايا BJ 0.05 ٪ التربسين / EDTA وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح على المديين المتوسط ​​والمتوسطة resuspend في النمو. إزالة لوحة متوسطة من التغذية MEF (انظر الخطوة 1.4) وإضافة 2 مل / إضافة لتعليق الخلية BJ. ينبغي أن يكون تركيز الخلايا حوالي 5 × 10 4 خلايا / جيد. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. استبدال المتوسطة بعد 24 ساعة من إعادة البذر مع الإنسان ES / خلية الجذع مستنبت (400 مل DMEM/F12 تستكمل مع 100 مل مصل تبديل خروج المغلوب ، 5 مل 10 ملي غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 5 مل 200 ملي L – الجلوتامين و 0.9 مل 55 ملم β – المركابتويثانول و 20 نانوغرام / مل bFGF المؤتلف الإنسان). تغيير المتوسط ​​كل 24 ساعة لمدة 7 أيام. بعد سبعة أيام ، وتغير متوسط ​​والمتوسطة MEF مكيفة (انظر القسم 2). 2. إعداد متوسطة MEF مشروطة البذور CF – 1 الخلايا المغذية MEF في الخلايا 2 × 5 10 / جيد على لوحة 6 2 مل بشكل جيد في وسط النمو MEF. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. تغيير متوسطة إلى الإنسان ES / IPS خلية متوسطة الثقافة. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. طاف جمع كل 24 ساعة لمدة أربعة أيام. تصفية طاف عبر مرشح 0.22 ميكرون. تكملة طاف مع 50 نانوغرام / مل من bFGF. 3. الجذع اختيار مستعمرة والركض حدد مستعمرة ES مثل البذور وإعادة الإنسان في مستنبت ES / IPS تستكمل مع 10 ميكرومتر من Stemolecule Y27632 على أطباق خلية ثقافة ما قبل المصنف مع CF – 1 الخلايا المغذية MEF. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. تغيير الثقافة المتوسطة كل 24 ساعة في الأيام السبعة الأولى (بدون المكمل مع Stemolecule Y27632). بعد سبعة أيام ، وتغير متوسط ​​والمتوسطة MEF مكيفة (انظر القسم 2 من أجل الإعداد). واصلنا الركض الخلايا حتى أظهروا نموذجية مورفولوجيا ES الإنسان. 4. Immunocytochemical فحص علامات تعدد القدرات غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. تحديد الخلايا مع 500 ميكرولتر من مثبت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. كتلة غير محددة وملزمة مع العازلة ميكرولتر 500 حظر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية محددة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (استخدمنا الهيئة – 1 – 81 ، الهيئة – 1 – 60 ، SSEA – 4 ، SSEA – 3 ، Oct4 ، Sox2 ، وNanog Lin28 في 1:100 التخفيفات). غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، والابتعاد عن الضوء (كنا عنزة المضادة للماوس الغلوبولين المناعي Cy3 المتقارن ، عنزة المضادة للماوس مفتش Cy3 المتقارن ، عنزة مكافحة الجرذ الغلوبولين المناعي Cy3 المتقارن والماعز المضادة الأرنب Cy3 المتقارن في التخفيفات 1:300). غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة دابي (تركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل) لغسل الماضي ، واحتضان 5 دقائق لتصور النوى. تحليل الخلايا تحت التكبير. الجزء 5 : النتائج الممثل 1. مورفولوجيا النتائج : وكانت الخلايا الليفية الإنسان القلفة (BJ) خلايا المشترك مع transduced Oct4 ، Sox2 ، Nanog وLin28. وقد لوحظت تغييرات شكلية في وقت مبكر اليوم بعد 4 تنبيغ ، وكتلة من الخلايا أصبحت أكثر معبأة بإحكام في يوم 17 (الشكل 1). واختير يدويا المستعمرات في يوم 25 و مثقف على الخلايا المغذية CF 1 MEF. لتسهيل تشكيل مستعمرة خلية الجذع بعد إعادة برمجة ، استخدمنا Stemolecule Y27632وهو مثبط ROCK ، لبذر ليلة وضحاها الأولي خلال كل مرور. وقد لوحظت خلايا الجذع مع المستعمرات مورفولوجية جيدة بعد ثلاث جولات متتابعة من مستعمرة انتقاء والركض. 2. التعبير عن علامات تعدد القدرات : لمزيد من تميز الخلية الجذع عزل المستعمرات ، وبحثنا عن وجود علامات تعدد القدرات المشتركة التي أعرب عنها في خلايا ES. عرض المستعمرات قوية القلوية الفوسفاتيز (ا ف ب) النشاط (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم تنفيذ كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) على مستعمرات الخلايا الجذع مع لجنة من الأجسام المضادة علامة محددة تعدد القدرات ، بما في ذلك علامات سطح الهيئة – 1 – 81 ، الهيئة – 1 – 60 ، SSEA – 4 – 3 SSEA وكذلك علامات النووية Oct4 ، وSox2 Nanog. كانت المستعمرات المعزولة الجذع إيجابية لجميع العلامات (الشكل 3). نتائج المحكمة الجنائية الدولية تظهر أن خلايا الجذع معارضها المناسبة التعبير علامة نمط تعدد القدرات ، مما يدل على أن هذه الخلايا الجذع تشبه خلايا غير متمايزة ES الإنسان. الشكل 1 : التغيرات المورفولوجية للخلايا transduced BJ. صور مشرقة من حقل مستعمرة نموذجية الخلية التي شكلت في الجذع (A) 4 أيام و (ب) 17 يوما تنبيغ بالوظائف. الشكل 2 : AP نشاط الخلايا BJ برمجتها. ثلاث مستعمرات مختلفة ملطخة Stemgent القلوية الفوسفاتيز كيت تلطيخ. الشكل 3 : التعبير عن الإنسان خلايا الجذع على مستويات عالية من علامات ES الخلية المحددة التالية : علامات سطح الهيئة – 1 – 81 ، الهيئة – 1 – 60 ، SSEA – 4 وSSEA – 3 ، وعلامات النووية 4 أكتوبر ، وNanog Sox2.