Выделение мышью перитонеальных клеток полости
Summary
Брюшной полости у млекопитающих содержит различные иммунные клеточные популяции важно для врожденного иммунного ответа. Эффективный метод изоляции требуется для биохимических и функциональных анализов этих клеток. Здесь мы предлагаем комплексный метод для изоляции брюшной полости в клетках мыши.
Abstract
Брюшной полости является мембраной и заполненные жидкостью брюшной полости млекопитающих, в котором содержится в печени, селезенке, большинство из желудочно-кишечного тракта и других внутренних органов. Она таит в себе число иммунных клеток, включая макрофаги, В-клетки и Т-клеток. Наличие большого числа наивных макрофагов в брюшную полость делает его предпочтительным местом для сбора наивно ткани резидент макрофагов (1). Брюшной полости также имеет важное значение для изучения В-клетки из-за наличия уникальных брюшную полость-нерезиденты В-клеток подмножество известного как B1 клеток в дополнение к обычной ячейки B2. В1 клетки подразделяются на B1a и B1b клеток, которые можно отличить по поверхности выражение CD11b и CD5. В1 клетки являются важным источником природных IgM обеспечения раннего защиту от разнообразных патогенов (2-4). Эти клетки аутореактивных в природе (5), но как они находятся под контролем, чтобы предотвратить аутоиммунные до сих пор не поняли полностью. Напротив, CD5<sup> +</sup> B1a клетки обладают некоторыми регуляторными свойствами в силу их Ил-10 производственных мощностей (6). Таким образом, клетки перитонеального B1 полости интересные популяции клеток для изучения из-за их различных функций и много нерешенных вопросов, связанных с их развитием и регулированием. Изоляции брюшной полости резидент иммунных клеток является сложным из-за отсутствия определенной структуры внутри брюшной полости. Наш протокол опишу процедуру получения жизнеспособных клеток иммунной из брюшной полости мышей, которые затем могут быть использованы для фенотипического анализа методом проточной цитометрии и для различных биохимических и иммунологических анализов.
Protocol
Discussion
Выделение перитонеальных клеток полости важный метод для изучения различных иммунных клеток, в первую очередь макрофаги и конкретные подмножества клеток. Хотя это простой процесс, Есть некоторые критические этапы. Наличие загрязняющих крови в собранных образцов следует избегать, чтобы получить чистые популяции клеток перитонеальной полости. Эвтаназия цервикальным сдвигом должно быть сделано аккуратно, чтобы избежать загрязнения крови в брюшной полости. Кроме CO 2 может быть использован. Кроме того, во время процедуры надлежащего ухода должны быть приняты, чтобы избежать проколов пузырь или любых других органов в брюшную полость. Восстановление большинство вводимой жидкости также имеет важное значение в ячейку доходности.
Эта процедура широко используется для изучения биологии макрофагов с умеренным количеством житель, нестимулированных макрофаги могут быть легко получены из брюшной полости, в отличие от трудоемкой задачей дифференциации миелоидных клеток-предшественников в зрелые макрофаги в пробирке, используя макрофаг колониестимулирующий фактор (8 , 9). Макрофагов выход из брюшной полости может быть улучшено с помощью метода тиогликолята выявление, хотя тиогликолята использование могло бы изменить физиологические свойства макрофагов (7).
В-клетки являются важной частью нашей иммунной системы играет решающую роль в обоих врожденного и адаптивного иммунитета. Среди различных субпопуляций В-клеток, В1 клетки составляют уникальное подмножество B клеток, участвующих в врожденного иммунитета, аутоиммунные заболевания и иммунной регуляции. В1 клетки в основном расположены в брюшной полости и не требуют пополнения. Они являются одним из первичных производителей природного IgM, которая обеспечивает первую линию защиты против ряда вирусов и бактерий (10-12). В1 клетки также основным источником IL-10 (6), который является важным цитокинов, участвующих в иммунной регуляции. Хотя некоторые исследования были проводиться с В1 клетки, по-прежнему есть возможности для дальнейшей оценки их контрастные функций, специально их регулирующей роли. Брюшную полость изолятор метод дает уникальную возможность изучить функции B1 клеток.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при частичной поддержке гранта NIH AI069358 и Фонда BloodCenter исследований.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD BBL | 211716 |
References
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O’Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
