Génération d'une seule cellule suspensions de tissus de souris de neurones

Pour travailler dans des conditions stériles, il est recommandé d'effectuer toutes les étapes d'une hotte à flux laminaire. 1. Matériaux Neural Tissue Kit de dissociation (P) (Composants: Solution 1,2, 3 et 4, de stockage tampon) Pré-Séparation Filtres (Facultatif) Perles de suppression myéline Les bêta-mercaptoéthanol gentleMACS dissociateur C Tubes Rotator Tube MACSmix HBSS (w / o) HBSS (w) Préparer les solutions suivantes avant de commencer le protocole: Hanks solution saline tamponnée sans cations divalents Ca 2 + ou Mg 2 + (HBSS (w / o) HBSS, standard, c'est à dire avec Ca 2 + et Mg 2 + (HBSS (w) Selon l'épitope d'antigène d'intérêt dans les applications ultérieures, utilisez soit la papaïne à base de tissus neuronaux dissociation Kit (P) ou de la trypsine à base de tissus neuronaux dissociation Kit (T). Préparer les solutions suivantes de la dissociation des tissus neuronaux du kit: Solution 2: ajouter des bêta-mercaptoéthanol à 0,067 mM Solution 4: dissoudre la poudre dans 0,7 ml de tampon de stockage (fourni dans le kit), mélanger délicatement (ne pas vortexer) Mélanger une enzyme: Pipeter 1,9 ml de solution 2 et 50 ul de solution 1 (tous deux de kit) dans un tube C et incuber pendant 10-15 min à 37 ° C. Cela est suffisant pour dissocier de 400 mg de tissu cérébral. 2. Dissociant le tissu neural Peser le tissu cérébral dans un tube contenant 1 ml de HBSS (w / o) Transfert cerveau de souris dans le tube C contenant 1950 ul de mélange enzymatique préchauffé 1. (REMARQUE: ce protocole est rédigé pour ≤ 400 mg, mais les volumes de solution peut être adaptée pour accueillir jusqu'à 1600 mg de tissu cérébral par Tube C) Placer le tube C sur le dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_brain_01". Incuber avec rotation (4 min en utilisant un tube Rotator MACSmix) pendant 15 min à 37 ° C. Placer le tube C sur le dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_brain_02". Pendant l'étape de dissociation de préparer 30 pi de 2 Mix enzyme par 400 mg de tissu par un léger mélange de 20 ul de la solution 3 et 10 ul de la solution 4. Ajouter 2 mélange enzymatique du métro C via le septum scellé bouchon et mélanger doucement sans vortex. Incuber le tube C avec rotation pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur. Placer le tube C sur le dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_brain_03". Incuber le tube C avec rotation pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur. Centrifuger brièvement pour prélever l'échantillon au fond du tube. 3. Filtration Sélectionner un assez grand filtre pour permettre le passage vers les cellules d'intérêt. Par exemple, les cellules de Purkinje sont trop grands pour passer à travers un filtre de 30 um, mais Prominin-1 + cellules. Utiliser une pipette suitable1000 ul pour éliminer les cellules forment le tube C à travers le septum scellé bouchon et l'appliquer à la pré-filtre de séparation sur un tube de prélèvement de 15 ml. (REMARQUE: pour des échantillons plus importants d'utiliser un tube de prélèvement de 50 ml). Laver le filtre avec 10 ml de HBSS (w). Centrifuger les cellules filtrées à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Reprendre le surnageant dans votre moyenne ou tampon de choix pour les applications ultérieures. Pour enlever les débris de myéline, l'utilisation Perles de suppression de myéline. 4. Résultat Représentant: S'il vous plaît voir Figures 1-3 Figure. 1 La dissociation du cerveau avec la dissociateur gentleMACS abouti à 97% de cellules viables, comme le montre l'analyse des flux de cytométrie. Figure. 2 photo Microscope optique de la formation Neurosphère après tri cellulaire magnétique en utilisant Anti-Prominin-1 microbilles après 7 jours de culture dans MACS ® NeuroMedium complétée par MACS supplément B27 PLUS. Les cellules ont été préparées à partir de cerveau de souris CD1 (P3) en utilisant le tissu neural dissociation Kit (P). Figure. 3 débris de myéline dans une seule cellule suspensions altère considérablement l'isolement cellulaire, et l'enlèvement des débris de myéline par les perles de suppression myéline accroît les séparations de cellules d'efficacité. Pour les séparations MACS utilisant Anti-Prominin-1 microbilles, P22 cerveau de souris a été dissociée en utilisant les tissus neuronaux dissociation Kit (P). Les cellules de la suspension à cellule unique ont été soit directement utilisé pour la séparation, ou ont été soumis à la myéline déplétion en utilisant des perles de suppression de myéline. En comparant la séparation à partir d'échantillons avec et sans suppression de la myéline, démontre que la pureté est supérieure pour les échantillons avec l'enlèvement de myéline précédente.