A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad
Summary
Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.
Abstract
Análisis de contenido de alta (HCA) se combinan los ensayos de las células y los reactivos de detección con imágenes automatizada y potentes algoritmos de análisis de imagen, permitiendo la medición de varios fenotipos celulares dentro de un único ensayo. En este estudio, hemos utilizado HCA para desarrollar un ensayo novedoso para la neurotoxicidad. Neurotoxicidad evaluación representa una parte importante de la evaluación de seguridad de los medicamentos, además de ser un importante foco de los esfuerzos de protección del medio ambiente. Además, la neurotoxicidad es también una buena aceptación<em> In vitro</em> Marcador del desarrollo de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el Parkinson. Recientemente, la aplicación de HCA a la selección neuronal ha sido reportado. Mediante el etiquetado, las células neuronales con βIII-tubulina, los ensayos de HCA puede proporcionar alto rendimiento, no subjetivo, la medición cuantitativa de parámetros como el número de neuronas, y la longitud de las neuritas contar neuritas, todo lo cual puede indicar efectos neurotóxicos. Sin embargo, el papel de los astrocitos permanece inexplorado en estos modelos. Los astrocitos tienen un papel fundamental en el mantenimiento del sistema nervioso central (SNC) la homeostasis, y están asociadas con la neuroprotección y neurodegradation cuando se activan en respuesta a sustancias tóxicas o enfermedades. GFAP es una proteína de filamentos intermedios expresa predominantemente en los astrocitos del sistema nervioso central. La activación de los astrocitos (gliosis) lleva a la regulación al alza de GFAP, comúnmente acompañado por la proliferación de astrocitos y la hipertrofia. Este proceso de gliosis reactiva ha sido propuesto como un marcador precoz de daño al sistema nervioso. El método tradicional para la cuantificación de GFAP es por inmunoensayo. Este enfoque es limitado por la incapacidad de proporcionar información sobre la localización celular, la morfología y el número de células. Se determinó que el HCA podría ser utilizado para superar estas limitaciones y medir simultáneamente múltiples funciones relacionadas con gliosis – cambios en la expresión de GFAP, la hipertrofia de los astrocitos, y la proliferación de astrocitos – dentro de un único ensayo. En los estudios de co-cultivo, los astrocitos se ha demostrado que protegen a las neuronas contra varios tipos de insultos tóxicos y de influir en forma crítica la supervivencia neuronal. Estudios recientes han sugerido que el uso de los astrocitos en un<em> In vitro</emNeurotoxicidad> sistema de prueba puede resultar más relevantes para la estructura y función del SNC humano de células neuronales solo. En consecuencia, hemos desarrollado un ensayo HCA para el co-cultivo de neuronas y astrocitos, compuesta por protocolos y validados, el objetivo de reactivos específicos para la detección de perfiles de βIII-tubulina y la proteína ácida glial fibrilar (GFAP). Este ensayo permite el análisis simultáneo de neurotoxicidad, crecimiento de las neuritas, gliosis, la morfología neuronal y los astrocitos y el desarrollo neuronal y de los astrocitos en una amplia variedad de modelos de celulares, lo que representa una novela, no subjetivo, de alto rendimiento de ensayo para la evaluación de la neurotoxicidad. El ensayo tiene un gran potencial para mejorar la detección de neurotoxicidad y mejora de la productividad en la investigación en neurociencias y el descubrimiento de fármacos.
Protocol
Discussion
Hasta la fecha, los experimentos in vitro diseñado para estudiar la evaluación de la neurotoxicidad de riesgo utilizando cultivos mixtos de neuronas y astrocitos han sido limitados. Es ampliamente aceptado que las células gliales son esenciales en la prestación de apoyo espacial y metabólica de las neuronas y juegan un papel fundamental en la modulación de diversas funciones neuronales, como la migración neuronal, la diferenciación y la actividad sináptica. Astrocitos gliales también liberan citoquinas y otros factores solubles que son capaces de inducir la tolerancia tanto en las respuestas adversas en los alrededores de tejido neuronal, así como la promoción de las neuronas de muchas toxinas. Demostrando la profundidad de interacción neuronal-glial, en los estudios de co-cultivo, los astrocitos se ha demostrado que protegen a las neuronas contra la toxicidad del estrés oxidativo, mientras que el deterioro de las funciones de los astrocitos, como el mantenimiento de la defensa antioxidante y los niveles de energía celular, se ha demostrado que críticamente influir en la supervivencia neuronal. Estudios recientes han sugerido que el uso de los astrocitos en un ensayo in vitro de la neurotoxicidad del sistema puede resultar más relevante para la salud humana la estructura del sistema nervioso central y la función de las células neuronales solo. A pesar de la creciente conciencia de la importancia fisiológica de las neuronas, los astrocitos interacciones, que ya ha sido difícil de realizar análisis cuantitativos de estas interacciones en células intactas. El advenimiento de filtrado de contenido de alta permite el desarrollo de poderosos nuevos ensayos para abordar esta cuestión.
En este estudio, hemos demostrado que el análisis cuantitativo de varios fenotipos neuronales y los astrocitos en un único ensayo son posibles gracias a HCA. En las neuronas primarias que han realizado las mediciones cuantitativas de los marcadores de neurotoxicidad como el número de neuronas, y la longitud de las neuritas contar las neuritas. En los astrocitos, gliosis reactiva es un marcador biológico conocido de la neurotoxicidad, caracterizada por alteraciones en la expresión de GFAP, el número de astrocitos y la morfología de los astrocitos. Hemos demostrado que cada uno de estos criterios de valoración puede ser fácilmente evaluada a través de HCA. Estos estudios apoyan el concepto de que el HCA de nervios específicos biomarcadores podría ser utilizado como parte de una batería de pruebas in vitro para detectar rápidamente grandes cantidades de productos químicos para los puntos finales neurotóxicos.
HCS222 kit de alta Millipore análisis de contenido de co-cultivo de neuronas y astrocitos se compone de reactivos de detección de alta calidad y protocolos para la creación de perfiles simultáneamente βIII-tubulina y la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) en una amplia variedad de modelos celulares de neurotoxicidad. Los reactivos altamente validados suministrado con el kit permiten al usuario estandarizar los ensayos, minimizar el ensayo a ensayo de la variabilidad, y para generar imágenes de forma reproducible con una elevada relación señal-a-fondo de relación.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los Dres. Rick Ryan, Umesh Patel, hasta que Jeff Hsu Mateo, Mistry Jehangir y Michele Hatler de apoyo durante el desarrollo de estos proyectos y los protocolos.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
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| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
| HCS imaging/analysis system |
References
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