Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Auftauen ES-Zellen (nicht im Video zu sehen) ES-Zellen werden in Medium mit 10% DMSO eingefroren. Da DMSO die Differenzierung von ES-Zellen induzieren kann, kann es möglich sein, die Zellen gegen Ende des Tages auftauen und so auf das Medium wechseln zum nächsten Morgen, um die Auswirkungen der verbleibenden DMSO zu minimieren. Coat einer 6-well Zellkultur-Platte mit 0,1% Gelatine für mindestens 15 min und absaugen unmittelbar vor der Platte Zellen auf. Thaw ES-Zellen (ca. 5 x 10 6 Zellen, was einem konfluenten 6-well) in einem 37 ° C Wasserbad und verdünnen in 10 ml vorgewärmtem ES-Zell-Medium. Pellet die Zellen durch Spinnen für 10 Minuten bei 1000 rpm in einer Tischzentrifuge klinischen Zentrifuge. Absaugen Medium und sanft die Zellen in 10 ml 37 ° C vorgewärmten Medium. Transfer-Zell-Suspension, die 6-Well-Platte und wachsen bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator. Ändern Medium am folgenden Tag, um tote Zellen und restliches DMSO zu entfernen. Passage und Expansion von ES-Zellkulturen ES-Zellen werden routinemäßig alle passagiert 2 / 3 Tage, und das Medium wird jeden zweiten Tag gewechselt. So erfordern ES-Zellen tägliche Aufmerksamkeit. Nach unserer Erfahrung wachsen Feeder-unabhängige ES-Zellen rascher und schneller versauern das Medium, Drehen gelb. Unter Berücksichtigung der Zellen an das Medium sauer (durch nicht verändern die Medien jeden Tag oder durch Passagieren der Zellen bei einer zu niedrigen Verdünnung) führt dazu, dass die Zellen Krise durchlaufen, Triggerung über Differenzierung und Zelltod, nach denen ihre Totipotenz nicht gewährleistet werden kann. Plating-Zellen bei einer zu niedrigen Dichte, unzureichende Verteilung der Zellen während der Passage, oder unebene Beschichtung können ähnliche Probleme verursachen, da die Zellen werden große Klumpen vor Erreichen der Konfluenz bilden und die Zellen in diesen Klumpen wird differenzieren oder zu sterben. Keimbahn-Getriebe ist ein deutlich in Zellen, die misshandelt worden sind, auch wenn sie zum Zeitpunkt der Injektion gesund erscheinen, reduziert. Für eine konfluente 6-Well-Platte von Zellen absaugen Medium ab und wäscht mit 2-3 ml 37 ° C vorgewärmt PBS, Pipettieren es von den Zellen weg. Cover-Zellen mit 1 ml 1 × Trypsin-Lösung für 3-4 Minuten oder bis die Zellen gleichmäßig in kleine Klumpen verteilt. 1 ml Medium, um das Trypsin zu inaktivieren. Sammeln trypsiniert Zellen und Platten-Zellen (in der Regel 2 / 5 gut), ein frisch verkleistert 6-Well-Platte. Freezing ES-Zellen Trypsinize einer konfluenten 6-Well-Platte (ca. 1 × 10 7 Zellen) wie oben beschrieben. Sammeln trypsiniert Zellen in 9 ml Medium und Pellet für 5 Minuten bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. Absaugen mittel-und resuspendieren Zellpellet in 1 ml der frisch zubereiteten Einfriermedium. Aliquot von 0,5 ml Zellen in zwei Kryoröhrchen. Frieren Sie das Fläschchen bei -80 ° C über Nacht und Transfer zum flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung. ChIP-on-Chip-VERFAHREN Immunpräzipitation Formaldehyd Vernetzung Zellen (Suspensionszellen) Verwenden Sie 5 x 07 bis 1 Oktober x 10 8 Zellen pro Immunpräzipitation. Add frischen Formaldehyd zu der Zellsuspension in einer Konzentration von 1%. Brütet Zellen mit Formaldehyd-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Add 1 / 10 Volumen von 1,25 M Glycin, Formaldehyd zu stillen. Spülen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml 1x PBS. Pool-Zellen in 50 ml konische Röhrchen und drehen sich mit 700g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Pellet in 1,5 ml Lysispuffer. Transfer-Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Flash-Freeze dreimal Zellen in flüssigem Stickstoff und die Verwendung eines Gewebes Mahlwerk Zellen zu brechen. Sobald Zellen vernetzt sind, können sie in gefrorenem Zustand bei -80 ° C unbegrenzt. Herstellung von magnetischen Kügelchen (Schritte sind bei 4 ° C) Add 50 ul Dynal Perlen bis 1,5 ml low retention Mikroröhrchen. Richten Sie 1 Tube Perlen pro Immunpräzipitation. 1 ml Block-Lösung. Sammle Perlen mit Dynal MPC. Die Röhrchen in magnetischen Rack. Lassen Sie Perlen auf der Seite des Röhrchens zu sammeln. Dies dauert etwa 15 s. Invert Rack zweimal zu helfen, um Perlen zu sammeln. Überstand entfernen mit Pipette. 1 ml Block-Lösung und sanft resuspendieren Perlen bei der Entfernung von den Magnetstreifen aus dem Rack und Invertieren der Stange, wobei die Rohre noch an seinem Platz – entweder 10-20 mal, oder bis die Kugeln gleichmäßig zu resuspendieren. Sammle Perlen wie oben beschrieben (Schritt 2). Überstand entfernen mit Pipette. Wash Perlen in 1,5 ml Block-Lösung, wie in Schritt 3 noch einmal. Resuspendieren Perlen in 750 ul-Block-Lösung und fügen 10 ug Antikörper. Inkubation bei 4 ° C für mindestens 6h, oder über Nacht auf einem Rotator. Wash Perlen drei times in 1 ml Block-Lösung, wie in Schritt 3 beschrieben. Zell-Beschallung Gefrorene Zellpellets von -80 ° C und Transfer Zellen Rohre für die Beschallung. Wir haben derzeit lieber auf den Grund zu einem Standard polupropylene, 15 ml konischen Rohr für die Beschallung zu verwenden. Wir schneiden das Rohr in zwei Stücke auf dem 5-ml-Markierung und entsorgen Sie die obere Hälfte. Tubes können mit Parafilm oder mit dem Schlauch Kappe abgedeckt werden beim Einrichten. Mit einem Mikrozentrifugenröhrchen Rack Position Rohr, so dass die Sonicator Sonde sitzt ca. 0,5-1,0 cm über dem Boden des Röhrchens. Achten Sie darauf, dass die Sonde zentriert ist und nicht in Kontakt mit den Seiten der Röhre. (Probe Positionierung kann, ob die Lösung Schäume oder nicht während der Beschallung zu beeinflussen. Typischerweise Schaumbildung zeigt, dass die beschallt DNA schlecht wird geschert werden.) Ultraschallbad Aufhängung 6 mal während 20 s. Die Proben sollten in einem Eis-Wasser-Bad während der Beschallung gehalten werden. Zur Verringerung Aufschäumen zunächst eingestellt Ausgangsleistung auf 0 und erhöhen manuell bis zur endgültigen Leistung während der ersten platzen. (Wenn es erhebliche Schaumbildung, können alle Blasen durch Zentrifugation bei 20.000 g durch vorsichtiges Resuspendieren des gesamten Materials entfernt werden, gefolgt, so dass keine Schaumblasen.) Spin bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C bis Pellet Schutt und Ernte der Überstand in ein 1,5 ml-Tube. Sparen Sie 50 ul Zelllysat aus jeder Probe als Input DNA. Lagerung bei -20 ° C. Zumindest ein Input DNA Aliquot sollte pro Charge beschallen Lysat gehalten werden. Beachten Sie, dass die Auswirkungen von den Auswirkungen der Beschallung und der daraus resultierenden Verteilung der Fragmentgrößen erst nach vernetzen Umkehr und Reinigung von DNA überprüft werden. Chromatin Immunopräzipitation Fügen Sie die Chromatin-Gegenwert von 5 x 07 bis 1 Oktober x 10 8 Zellen von Cell Beschallung, Schritt 4, um die 50 ul Antikörper / Magnetic-Bead-Mix aus Vorbereiten magnetische Kügelchen, Schritt 6 mit einem Gesamtvolumen von 1 ml (Es kann möglich, mit Lysepuffer, wenn überhaupt) einstellen. Inkubieren über Nacht auf Rotator bei 4 ° C. Waschen Sammle Perlen mit Dynal MPC. Die Röhrchen im Rack. Lassen Sie Perlen auf der Seite des Röhrchens zu sammeln. Dies sollte zu etwa 20 s. Invert Rack zweimal zu helfen, sammeln Sie alle Perlen. Überstand entfernen mit Pipette, wechselnde Spitzen zwischen den Proben. 1 ml Lysepuffer in jedes Röhrchen und sanft resuspendieren Perlen. Dies kann durch Entfernen der Magnetstreifen aus dem Rack und Invertieren der Rack erfolgen, mit Röhren noch an seinem Platz – 10-20 mal, oder bis die Beads gleichmäßig suspendiert. Sammle Perlen. Überstand entfernen, indem Pipette. Wiederholen Sie diesen waschen 5 weitere Male, wechselnde Spitzen zwischen Wäschen. Wash Perlen 6-mal in 1 ml IP1 Buffer, wie in Schritt 2 beschrieben. Wash Perlen 6-mal in 1 ml IP2 Buffer, wie in Schritt 2 beschrieben. Wash Perlen 6-mal in 1 ml TE 8,0 Puffer, wie in Schritt 2 beschrieben. Spin bei 960g für 3 min bei 4 ° C und entfernen Sie alle verbleibenden TE-Puffer. Elution Add 210 ul Elutionspuffer eluieren und Material aus Perlen durch Inkubation die Röhrchen in einem 65 ° C Wasserbad für 15 min. Vortex kurz alle 2 min. Diese Inkubation kann bis zu 30 min, die zur Verbesserung Erholung des Eluats kann verlängert werden. Spin down Perlen bei 16.000 g für 1 min bei Raumtemperatur. Nehmen Sie 200 ul des Überstandes und Transfer zum neuen Rohr. Das Material kann bei -20 ° C eingefroren und über Nacht gelagert. Crosslink Umkehr Reverse-Vernetzung der Immunpräzipitation DNA aus Elution, Schritt 3 durch Inkubation bei 65 ° C für mindestens 6 h und einem Maximum von 15 h (Längere Zeiten vernetzen Umkehr in der Regel zu einer erhöhten Lärm in der Microarray-Analyse ergeben). Diese Inkubation kann in einem Ofen durchgeführt werden, so dass das Rohr gleichmäßig und beheizt gibt es weniger Kondenswasser gebildet. Tauwetter 50 ul DNA-Eingang nach Beschallung vorbehalten (Schritt 13), fügen Sie 150 pl (3 Bände) Elutionspuffer und mischen. Rückwärts vernetzen dieser Eingang DNA durch Inkubation bei 65 ° C wie in Crosslink Umkehr, Schritt 1. Ab diesem Zeitpunkt ist jedes Rohr Immunpräzipitation oder Input-DNA als separates Rohr oder Probe für spätere Bearbeitungsschritte werden. Reinigung DNA Add 8 ul 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 mg ml-1 Endkonzentration), mischen durch Invertieren des Röhrchens mehrmals und bei 37 ° C für 2 h. Add 4 ul 20 mg ml-1 Proteinase K (0,2 pg ml-1 Endkonzentration) und mischen durch Invertieren des Röhrchens mehrmals und Inkubieren bei 55 ° C für 2 h. Add 400 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (P: C: IA), Vortex-und getrennten Phasen mit 2 ml Schwere Phaselock Rohr (folgen Sie den Anweisungen von Eppendorf zur Verfügung gestellt). Wenn die P: C: IA-Lösung ist zu alt oder ist bei niedrigen pH-Wert, wird es degr werdenadation der DNA, was zu Lärm in der Microarray-Analyse und der Verlust der Nachweis der gültigen Ziele. Transfer wässrige Schicht auf neue Zentrifugenröhrchen mit 16 ul 5 M NaCl (200 mM) Endkonzentration) und 1,5 ul 20 μ ul-1 Glykogen (30 ug Gesamt). Add 800 ul EtOH. Inkubieren über Nacht bei -20 ° C oder 30 min bei -80 ° C. Spin bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C bis Pellet DNA. Wash Pellets durch Zugabe von 500 ul 80% EtOH, Vortexen zu Pellet und Spinnen wieder bei 20.000 g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie alle verbleibenden 80% EtOH. Drehen Sie das Röhrchen kurz, um alle verbleibenden Flüssigkeit zu sammeln und zu entfernen mit einem pipetteman Flüssigkeit, die Vermeidung der Pellets. Lassen Rohre an der Luft trocknen, bis Pellets nur trocken: Pellets sollte trotzdem noch eine feuchte Aussehen. Resuspendieren jedes Pellet in 70 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Übertrocknung dieser Pellets können sie nur schwer zu resuspendieren, oder verpflichtet ist, blättert nicht ab und lösen sich von der Seite der Röhre. Optional: Speichern 15 ul Immunpräzipitation Probe für eine spätere Verwendung. Dieses Material kann verwendet werden, um Gen-spezifische PCR Bestätigung der Microarray-Ergebnisse durchzuführen. Quantify Konzentration durch UV-Absorption (260 nm). NB: Die folgenden Schritte, einschließlich Bibliothek Vorbereitung und Verstärkung nutzen ein modifiziertes GenomePLex WGA-Kit mit 10-fach Amp Mix von Sigma ohne dNTPs: Bibliothek Vorbereitung Erhältlich in den GenomePLex WGA-Kit mit 10-fach Amp Mix von Sigma Add 2 ul 1X Bibliothek Vorbereitung Buffer zu 10 ul der DNA-Probe aus der Reinigung DNA, Schritt 11 in einem PCR-Röhrchen. Add 1 ul-Bibliothek Stabilisierung Solution. Vortex gründlich durch Zentrifugation zu konsolidieren, und in den Thermocycler bei 95 ° C für 2 Minuten. Danach wird die Probe auf Eis, durch Zentrifugation durch Zentrifugation zu konsolidieren, und dann wieder zu Eis. Add 1 ul-Bibliothek Vorbereitung Enzyme, gründlich vortexen und anschließend kurz zentrifugieren. Wägegut in einem Thermocycler und inkubieren wie folgt: 16 ° C für 20 Minuten 24 ° C für 20 Minuten 37 ° C für 20 Minuten 75 ° C für 5 Minuten 4 ° C zu halten Nehmen Sie Proben von Thermocycler und kurz zentrifugieren. Die Proben können sofort verstärkt werden, oder bei 20 ° C für 3 Tage gespeichert. Verstärkung Erhältlich in den GenomePLex WGA-Kit mit 10-fach Amp Mix von Sigma Ein Master-Mix wird durch Addition der folgenden Reagenzien, die 15 ul Reaktion aus Schritt 3 vorbereitet, unten: 7,5 ul 10X Amp Mix (ohne dNTPs) 5,0 ul der WGA-DNA-Polymerase 3,0 ul einer 10 mM dNTP (je) Lager (Endkonzentration 0,4 mM) Bringen Endreaktionsvolumen auf 75 ul mit Nuklease-freiem Wasser Vortex gründlich. Kurz zentrifugieren und beginnen Thermocycling. Initiale Denaturierung 95 ° C für 3 Minuten Führen Sie 14 Zyklen wie folgt: Denaturieren 94 ° C für 15 Sekunden Glühen / Extend 65 ° C für 5 Minuten Nach dem Radfahren abgeschlossen ist, halten die Reaktionen bei 4 ° C oder bei -20 ° C bis zur Analyse bereit oder Reinigung. Purify die DNA mit PCR Purification ® Kit von Quiagen nach den Anweisungen des Herstellers und zu quantifizieren Konzentration durch UV-Absorption (260 nm). Führen Sie erneut einen Zyklus von Verstärkung aus der Bibliothek Vorbereitung, Schritt 1 bis Amplification, Stufe 2, mit folgenden Anpassungen. • Hinsichtlich der Menge der benötigten DNA aus Schritt 3 oben, um die Fragmentierung zu initiieren: Wenn die Konzentration der DNA ist etwa 200-300 g / ml, für 2,5 ul Probe und passen mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 ul. Wenn die Konzentration der DNA ist etwa 50-60 pg / ml, verwenden Sie 5 ul der Probe und passen mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 ul. • In diesem zweiten Amplifikation Prozess wird dNTPs mit dTTPs für den Master-Mix Austausch für eine Mischung mit 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP und 8 mM dTTP und 2 mM dUTP in der gleichen Konzentration, dass die bisherige Mischung. Messen DNA mittels UV-VIS Spektralphotometer (260 nm). Normalerweise ist größer als 9 pg amplifizierte DNA von jeder Reaktion erhalten. NB: Die Beschriftung der DNA-Targets mit der GeneChip durchgeführt ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix nach den Anweisungen des Herstellers, wie nachfolgend beschrieben: Fragment verstärkt Ziele Fragment der Proben unter Verwendung der entsprechenden Tabelle unten je nachdem, was Array-Typ wird das Ziel sein Hybrid-das Meerwasser mit. Tabelle 1. Fragmentation Mix für einzelne Arrays Component Volume / Betrag in 1 Rxn Doppelsträngige DNA 7,5 ug 10X cDNA Fragmentation 4,8 ul UDG, 10 U / ul 1,5 ul APE 1, 100 U / ul ul 2,25 Nuklease-freies Wasser bis zu 48 ul Erhältlich in den GeneChip ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix Tabelle 2. Fragmentation Mix für Multi-Array-Sets Component Volume / Betrag in 1 Rxn Doppelsträngigen DNA-9 ug 10X cDNA Fragmentation 4,8 ul UDG, 10 U / ul 1,5 ul APE 1, 100 U / ul ul 2,25 Nuklease-freies Wasser bis zu 48 Erhältlich in den GeneChip ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix Set up Fragmentierung Mix entweder nach den Tabellen oben. Flick-mix und Spin-down der Rohre. Inkubieren Sie die Reaktionen an: 37 ° C für 1 h. 93 ° C für 2 min. 4 ° C für mindestens 2 Minuten. Flick-mix, Spin-down der Rohre und Transfer 45 ul der Probe in ein neues Röhrchen. Nehmen Sie 2 ul von jeder Probe für Gel-Shift-Analyse. Label fragmentiert doppelsträngige DNA Bereiten Sie die doppelsträngige DNA-Labelling Mix wie in der folgenden Tabelle beschrieben: Tabelle 3. Zusammensetzung der doppelsträngigen DNA-Labelling Mix Component Volume / Betrag in 1 Rxn 5X TdT-Puffer 12 ul TdT 2 ul DNA Labelling Reagent, 5 mM 1 ul Gesamtvolumen 15 ul Erhältlich in den GeneChip ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix Add 15 ul des doppelsträngigen DNA Labeling Mix, um die DNA-Proben, Flick-mix und Spin sie nieder. Inkubieren Sie die Reaktionen an: 37 ° C für 60 min. 70 ° C für 10 min. 4 ° C für mindestens 2 min. Nehmen Sie 2 ul von jeder Probe für Gel-Shift-Analyse. Gel-Shift-Analyse Bereiten Sie einen 4% igen Agarosegel. Inkubieren Proben aus Fragment verstärkt Ziele, Schritt 5 und Label fragmentiert doppelsträngige DNA, Schritt 4 bei 65 ° C für 2 min. Add 10 ul Streptavidin (1 mg / ml), und inkubieren Proben bei Raumtemperatur für 5 min. Run Proben aus Schritt 3 auf einem 4% igen Agarosegel (Gel-Shift-Analyse, Schritt 1), um die Verschiebung der Migration der Kennzeichnung von Produkten zu prüfen. Array Hybridisierung und Waschen Array Aufgeführt von der Genomic Center der University of California Riverside. Array-Analyse Durchgeführt durch rechnerische Analyse. Pufferzusammensetzungen: Block-Lösung: PBS + 0,5% Rinderserumalbumin (BSA). Lysis Buffer: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 140 mM NaCl 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0,1% SDS 1mM PMSF Finale pH 7,5 IP1: Lysis Buffer + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM LiCl 1 mM EDTA 0,5% NP-40 0,5% Sodium Dioxycholat Finale pH 8,0 TE: 10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA Finale pH 8,0 Elutionspuffer: TE-Puffer + 1% SDS.