从人类胚胎干细胞的染色质免疫沉淀

解冻胚胎干细胞（不视频特色） ES细胞中含有10％DMSO介质被冻结。由于DMSO可诱导ES细胞的分化，它可以解冻的细胞在一天中较晚等，以改变介质的次日早晨，以尽量减少残留的DMSO的影响。 外套6以及组织文化与0.1％，为至少15分钟的明胶板和吸立即关闭前板细胞。 在37℃水浴解冻胚胎干细胞（约5 × 10 6细胞，相当于一个汇合6井），并稀释成10毫升预热ES细胞培养基。 颗粒细胞10分钟在1000转的旋转，在台式临床离心机。 吸了10毫升37℃预热介质中轻轻悬浮细胞。 细胞悬液转移到6孔板，生长在37 °饱和湿度5％的CO 2培养箱中的彗星。 中等翌日更改，去除死细胞和残余二甲基亚砜。 旅费和扩大胚胎干细胞培养 ES细胞常规传代，每2 / 3天，中期隔日改变。因此，胚胎干细胞需要每天关注。根据我们的经验，馈线独立的ES细胞生长迅速，很快酸化媒介，把它发黄。并使细胞酸化中（不改变媒体每天或通过传代太低稀释细胞），将导致细胞经过危机，引发多余的分化和细胞死亡，之后，他们的全能性无法得到保证。在密度太低，细胞通过分散在不足，或不均匀电镀电镀细胞可引起类似的问题，细胞达到汇合之前，将形成大团块，这些团块内的细胞会分化或死亡。生殖系的传输是在受到虐待，甚至当他们出现在注射时的健康细胞明显减少。 对于一个融合的6孔细胞板吸介质，并用2-3毫升37℃预热PBS，吹打细胞。 盖细胞与1毫升1 × 3-4分钟或直至细胞是均匀分散成小团块的胰蛋白酶的解决方案。 加入1毫升的中型灭活胰蛋白酶。 胰酶消化的细胞和板细胞（通常是良好的2 / 5）收集新鲜糊化的6孔板。 冷冻胚胎干细胞 Trypsinize一个汇合6孔板（约1 × 10 7细胞）如上所述。 收集9毫升，5分钟1000转的介质和颗粒胰酶消化细胞。 吸1毫升新鲜配制的冻结介质中和悬浮细胞沉淀。分装成两个cryotubes 0.5毫升的细胞。 小瓶冷冻在-80 ° C过夜，并转移到长期贮存的液氮。 芯片上的芯片程序免疫沉淀甲醛交联细胞（悬浮细胞） 使用5 × 10 7 – 1 × 10 8各免疫细胞。 添加新鲜的甲醛的浓度为1％的细胞悬液。 孵化与甲醛溶液在室温下10分钟的细胞。 添加量1 / 10 1.25米甘氨酸解渴甲醛。 10毫升的1X PBS冲洗细胞两次。 池细胞在50 ml锥形管和自旋700克为5分钟，4 ° C。丢弃在1.5毫升细胞裂解液上清，重悬沉淀。转入1.5 ml离心管中的细胞。 闪存冻结三次在液氮中的细胞和使用组织磨床，打破细胞。一旦细胞的交联，他们可能会储存在-80℃无限期冻结。 准备磁珠 （步骤都执行在4 ° C） 加入50μLDYNAL珠1.5毫升低保留微管。设置1％免疫珠管。添加1毫升座溶液。 收集珠使用DYNAL MPC。机架放置在磁场的管。允许珠收集管侧。这应采取约15秒。反转机架两次，以帮助收集珠。用移液器取出上清液。 添加删除从机架的机架和反相磁条1毫升座的溶液轻轻悬浮珠，仍实行管 – 无论是10-20倍，或直至珠均匀悬浮。收集以上（步骤2）珠。用移液器取出上清液。 在1.5毫升座溶液清洗珠，在第3步，再一次。 重悬珠在750μL座解决方案，并添加10微克的抗体。最低为6h，或在4℃孵育过夜，上肩。 洗净珠三个吨1毫升座解决方案中的IME，在第3步。 细胞超声从-80 ° C和转移细胞对超声管取出冷冻细胞颗粒。目前，我们宁愿使用超声一个标准polupropylene的底部，15毫升锥形管。我们切管两件在5毫升标记和丢弃的上半部。管，可覆盖封口膜或管帽而设立。 使用离心管架，管的位置，所以坐在sonicator探头约0.5-1.0厘米以上的试管底部。小心探头为中心，不接触管双方。 （影响的解决方案是否泡沫或没有在超声探头定位，通常情况下，发泡表明，超声的DNA将会很差剪​​切。） 超声期间暂停第20号第6次样品应存放在一个冰水浴在超声。为了减少起泡，最初设定的输出功率为0，并增加手动先是一阵，最终的功率。 （如果有显着的泡沫，所有泡沫可以被删除，离心20,000克，温柔的所有材料的再悬浮，没有留下泡沫的气泡。） 20,000克的自旋为10分钟，4 ° C至颗粒碎片和收获上清液1.5毫升管。 从每个输入的DNA样本保存50μL细胞裂解液。储存在-20 ° C。至少有一个输入的DNA分装应保持每批超声裂解。注意：只能交联逆转和DNA纯化后检查，超声和产生的片段大小分布的影响的影响。 染色质免疫沉淀添加染色质等值金额的5 × 10 7 – 1 × 10 8细胞从细胞超声，第4步到50μL抗体/磁珠组合最终体积为1 mL（可从准备磁珠 ，第6步裂解液，如果有的话）可能调整。上肩孵育过夜，4 ° C。 洗收集珠使用DYNAL MPC。在机架上放置管。允许珠收集管侧。这应该是采取约20秒。反转机架两次帮助收集所有珠。用移液器取出上清液，改变样本之间的秘诀。 加入1毫升每管的细胞裂解液，轻轻悬浮珠。这可以通过删除从机架的机架和反相磁条，仍然在地方管 – 10-20次，或直至均匀重悬珠。收集珠子。由移液器取出上清液。重复洗5次以上，改变之间的洗涤提示。 洗净珠在1毫升IP1缓冲区，在步骤2中所述，的6倍。 1毫升IP2的缓冲液洗珠的6倍，在步骤2中所述。 洗净珠在1毫升TE 8.0缓冲区，在步骤2中所述，的6倍。 在960克自旋为3分4 ° C和清除残留的TE缓冲液。 洗脱从珠中添加了65℃，15分钟的水浴中孵育管210μL洗脱缓冲液洗脱材料。涡简要每2分钟。这潜伏期可以延长，只要30分钟，这可以帮助提高回收洗脱液。 在室温下1分钟在16000克离心珠。 取出200μL上清转移到新管。材料可以被冻结在-20 ° C，存储在一夜之间。 交联逆转反向交联的免疫DNA 洗脱 ，第3步，在65℃孵育至少6小时和15小时（交联逆转更长的时间通常会导致增加的微阵列分析噪声）的最大。这潜伏期可以做到的烘箱中，使管受热均匀，有凝结而成较少。 解冻后超声保留输入DNA（13步）50μL，加150μL洗脱缓冲液和混合（3卷）。逆向孵化在65 ° C的交联逆转 ，第1步输入的DNA交联。从这一点来说，每管免疫或输入的DNA被认为是一个单独的管或以后的处理步骤的样品。 纯化的DNA 添加10毫克ml – 1的RNaseA（0.2毫克ml – 1的最终浓度），8μL混合颠倒几次管和37 ° C为2小时。 加入4μL20毫克ML – 1蛋白酶K（ML – 1终浓度为0.2微克）和混合逆变管数次，在55 ° C孵育2小时。 加入400μL酚：氯仿：异戊醇（P：C：IA），涡和2毫升重Phaselock管（Eppendorf公司提供的指示）不同的阶段。 如果P：C：IA解决方案是旧的，或在低pH值条件下，将会有degradation的DNA，造成噪音在微阵列分析和检测的有效目标的损失。 水层转移到新的离心管中，含有16微升5M氯化钠（200毫米）的最终浓度）和1.5μL20μμL- 1的糖原（30μg总）。 加入800μL乙醇。孵育过夜，在-20 ° C或30分钟在-80 ° C。 旋转20,000 10分钟克在4 ° C沉淀DNA。通过加入500μL80％乙醇，涡旋重新悬浮颗粒和纺纱再次在20000克在4 ° C 5分钟洗净颗粒删除任何剩余的80％乙醇。旋转管简要收取任何剩余的液体，并删除液体pipetteman，避免沉淀。让管空气干燥，直到颗粒干燥颗粒仍然保留着湿润的外观。在70 10毫米的Tris – HCl，pH值8.0μL重悬沉淀。 Overdrying这些颗粒可以使他们很难重悬，或片状剥离管方承担责任。 可选：15μl免疫沉淀样品的保存供日后使用。这种材料可以用来进行基因特异性PCR基因芯片结果的确认。 量化紫外吸收光谱（260纳米）的浓度。 注：库准备和扩增使用自Sigma 10X dNTPs混合放大器在不加修改的GenomePLex WGA的工具包，包括以下步骤： 图书馆准备可在自Sigma 10X放大器组合GenomePLex WGA的试剂盒 1X图书馆制备缓冲液中加入2μL，10μLDNA样本的纯化 DNA，在PCR管中的步骤11。 添加1μL图书馆稳定解决方案。 涡彻底，离心巩固，并在95个热循环地点° C为2分钟。 清凉冰样品，巩固离心，离心，然后返回冰。 新增图书馆制备酶1μL，旋涡彻底，然后短暂离心。 放置在一个热循环仪和孵化为样本如下： 16℃20分钟 24 ° C为20分钟 37℃20分钟 75℃5分钟 4℃举行从热循环仪和离心样品。样品可立即放大，或储存在20 ° C三天。 放大可在自Sigma 10X放大器组合GenomePLex WGA的试剂盒一个主混音准备从第3步到15μl反应体系中加入以下试剂，如下： 7.5μl的10X放大器组合（无dNTPs） WGA的DNA聚合酶5.0μL 3.0μL10毫米的dNTP（每件）股票（终浓度为0.4毫米） 使最终反应体积为75μL无核酸酶水涡彻底。短暂离心，并开始热循环。 预变性95℃3分钟执行14个周期如下： 变性94℃15秒退火/延伸65℃5分钟骑自行车是完成后，保持在4反应° C或储存在-20 ° C，直到准备进行分析或净化。 净化从Quiagen ®试剂盒PCR纯化的DNA，根据制造商的指示和量化紫外吸收光谱（260纳米）的浓度。 再次执行周期从图书馆准备扩增，通过扩增 ，第2步1步，与下面的修改。 •关于从第3步，上面开始碎裂过程所需的DNA量：如果DNA的浓度大约是200-300微克/毫升，使用2.5μL的样品和水调整最终体积为10μL。 如果DNA浓度约50-60微克/毫升，使用5μL的样品和水调整最终体积为10μL。 •在这第​​二个放大过程中，与主结构dTTPs dNTPs是一个包括10毫米的dATP，dGTP 10毫米，10毫米dCTP和8毫米dTTP的和在相同浓度下，前面的混合2毫米的dUTP混合交换。 测量DNA用紫外可见分光光度计（260纳米）。通常情况下，大于9微克扩增的DNA是从每一个反应。 注：标签的DNA目标是与基因芯片®聚双链DNA终端Affymetrix公司的标签根据试剂盒制造商的指示，分述如下： 片段扩增目标片段样品，用适当的表格，下面根据数组类型的目标将是混合动力通信指定到。 表1。单一阵列的碎片混合 组件数量/金额1 RXN 双链DNA 7.5微克 10X的基因碎片4.8μL UDG的，10 U /μL1.5μL APE 1，100 U /μL2.25μL 无核酸酶水至48μL 采用的基因芯片®聚双链DNA终端从Affymetrix公司的标签套件 表2。多阵列组的碎片混合 组件数量/金额1 RXN 双链DNA 9微克 10X的基因碎片4.8μL UDG的，10 U /μL1.5μL APE 1，100 U /μL2.25μL 无核酸酶水多达48个采用的基因芯片®聚双链DNA终端从Affymetrix公司的标签套件根据以上任一表碎片混合。弗里克组合和自旋向下的管子。 孵化的反应： 37℃1小时。 93℃2分钟。 4℃至少2分钟。 弗里克的组合，自旋向下的管道，并转移到一个新的管45μL的样品。 取出凝胶移位分析每个样品2μL。 标签零散的双链DNA 准备的双链DNA标签组合如下表所述： 表3。双链DNA标签混合组成 组件数量/金额1 RXN 5X TDT缓冲区12μL TDT 2μL DNA标签试剂，5毫米1μL 总体积15μL 采用的基因芯片®聚双链DNA终端从Affymetrix公司的标签套件加入15μL的双链DNA标记混合的DNA样本，弹簧组合，旋转下来。 孵化的反应： 37℃60分钟。 70 ° C时为10分钟。 4℃至少2分钟。 取出凝胶移位分析每个样品2μL。 凝胶移位分析准备了4％的琼脂糖凝胶。 孵育样本片段扩增的目标 ，步骤5 和标签零散的双链DNA，第4步在65 ° C为2分。 添加10μL链霉亲和素（1毫克/毫升），并在室温下5分钟的孵育。 运行步骤3在4％琼脂糖凝胶（ 凝胶移位分析 ，第1步）的样本，以检查的标志产品的转变迁移。 阵列杂交及洗涤阵列由加州大学河滨基因组的中心。 阵列分析执行的计算分析。 缓冲组合物： 座解决方案：PBS + 0.5％牛血清白蛋白（BSA）。 裂解缓冲液：50毫米的HEPES – KOH，pH值7.5 140毫米氯化钠 1毫米EDTA 1％的Triton X – 100 0.1％SDS 1MM PMSF 最终pH值7.5 IP1：裂解液+ 500毫米氯化钠 IP2：10毫米的Tris – HCl 250 mM的氯化锂 1毫米EDTA 0.5％NP – 40 0.5％的钠Dioxycholat 最终pH值8.0 TE：10毫米的Tris，pH值7.4 1毫米EDTA 最终pH值8.0 洗脱缓冲液：TE缓冲液+ 1％SDS。