הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

ES תאים הפשרה (לא מומלצים ב וידאו) תאים ES קפואים בינוני המכילה DMSO 10%. מאז DMSO יכול להשפיע על התמיינות תאים ES, זה יכול להיות אפשרי להפשיר את התאים בסוף היום, וכך לשנות את המדיום למחרת בבוקר כדי למזער את ההשפעות של DMSO שיורית. מעיל 6-גם בתרבית רקמה צלחת עם 0.1% ג'לטין דקות לפחות 15 ואת לשאוב מיד לפני לתאי על צלחת. ES הפשירי תאים (כ 5 × 10 6 תאים, שווה ערך ל ומחוברות אחד 6-היטב) בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים לדלל לתוך 10 מ"ל של מדיום ES prewarmed התא. גלולה התאים על ידי ספינינג במשך 10 דקות ב 1000 סל"ד בצנטריפוגה הספסל העליון קליני. לשאוב את המדיום ותאי resuspend בעדינות 10 מ"ל של 37 ° C prewarmed בינוני. תא העברת ההשעיה לצלחת 6-הבאר לגדול ב 37 מעלות צלזיוס humidified 5% CO 2 באינקובטור. שנה בינונית למחרת כדי להסיר תאים מתים DMSO שיורית. מעבר והרחבה של תרביות תאים ES לתאי גזע עובריים הם passaged שגרתי כל 2 / 3 ימים, את המדיום משתנה לסירוגין. לכן, תאים ES דורשים טיפול יומיומי. מניסיוננו, מזין עצמאית תאים ES לצמוח במהירות במהירות להפוך לחומצה הבינוני, להפוך אותו בצהוב. לאפשר לתאים להפוך לחומצה הבינוני (לא על ידי שינוי בתקשורת כל יום או passaging התאים בדילול נמוך מדי) יגרום לתאים לעבור משבר, מפעילה בידול עודף מוות של תאים, אשר לאחר מפוטנציית שלהם לא ניתן להבטיח. תאים ציפוי בצפיפות נמוכה מדי, פיזור מספיק של תאים במהלך המעבר, או ציפוי אחיד עלול לגרום לבעיות דומות, כמו התאים ייצרו גושים גדולים לפני שהגיע מפגש והתאים בתוך גושים אלה יבדיל או למות. Germline השידור היא הקטינה באופן משמעותי בתאים שהיו מתעללים, גם כאשר הם מופיעים בריא בזמן ההזרקה. עבור צלחת 6-ומחוברות היטב של תאים לשאוב בינוני את ולשטוף עם 2-3 מ"ל של 37 ° C prewarmed PBS, pipetting זה מן התאים. תאים עם מכסים מ"ל 1 של 1 × פתרון טריפסין במשך 3-4 דקות או עד תאים מפוזרים באופן אחיד לגושים קטנים. הוסף 1 מ"ל של המדיום כדי להשבית טריפסין. איסוף תאים trypsinized ותאי צלחת (בדרך כלל 2 / 5 של באר) לצלחת 6-gelatinized גם עתה. ES הקפאת תאים Trypsinize צלחת 6-ומחוברות היטב (כ -1 × 10 7 תאים) כפי שתואר לעיל. איסוף תאים trypsinized ב 9 מ"ל של גלולה בינונית במשך 5 דקות ב 1000 סל"ד. לשאוב את המדיום הסלולרי גלולה resuspend ב 1 מ"ל של מדיום קפוא וטרי. Aliquot 0.5 מ"ל של תאים לשני cryotubes. להקפיא את בקבוקונים ב -80 ° C לילה ולהעביר חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך. שבב על שבב נוהל Immunoprecipitation Crosslinking פורמלדהיד תאים (עבור תאים ההשעיה) השתמש 5 x 07-01 אוקטובר 10 x 8 תאים עבור כל immunoprecipitation. הוסף פורמלדהיד טריים ההשעיה התא בריכוז של 1%. דוגר תאים עם פתרון פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוספת נפח 1 / 10 של 1.25 M גליצין להרוות פורמלדהיד. יש לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של 1x PBS. בריכת תאים 50 צינורות חרוטי מ"ל ו – ספין על 700g 5 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 1.5 מ"ל של הצפת תמוגה. העברת התאים צינור מ"ל 1.5 microfuge. פלאש להקפיא שלוש פעמים תאים בחנקן נוזלי להשתמש במטחנת רקמות לשבור את התאים. לאחר התאים crosslinked, הם עשויים להיות מאוחסנים קפוא ב -80 ° C ללא הגבלת זמן. הכנת חרוזים מגנטיים (פעולות מבוצעות בבת 4 ° C) הוסף 50 μl של חרוזים Dynal עד 1.5 microtube שימור נמוך מ"ל. הגדרת 1 שפופרת של חרוזים לכל immunoprecipitation. הוסף 1 מ"ל בלוק פתרון. איסוף חרוזים באמצעות Dynal MPC. המקום צינורות מתלה מגנטי. אפשר לאסוף חרוזים בצד של הצינור. זה אמור לקחת בערך 15 s. היפוך מתלה פעמיים כדי לעזור לאסוף את החרוזים. הסר supernatant עם pipettor. הוסף 1 מ"ל בלוק פתרון וחרוזים resuspend בעדינות להסיר את פס מגנטי מהמדף מתלה היפוך, עם צינורות עדיין במקום – או 10-20 פעמים, או עד חרוזים הם resuspend שווה. איסוף חרוזים לעיל (שלב 2). הסר supernatant עם pipettor. לשטוף חרוזים בפתרון 1.5 בלוק מ"ל, כמו שלב 3, עוד פעם אחת. Resuspend חרוזים בפתרון בלוק 750 μl ולהוסיף 10 מיקרוגרם של הנוגדן. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 6 שעות, או לילה, על הכתף. לשטוף חרוזים שלוש Ximes בפתרון מ"ל 1 בלוק, כמתואר שלב 3. תא sonication הסר את כדורי תא קפוא מ -80 תאים ° C ו להעביר צינורות עבור sonication. בשלב זה אנו מעדיפים להשתמש התחתון של polupropylene רגיל, 15 מ"ל צינור חרוטי עבור sonication. אנחנו חותכים את הצינורית שתי חתיכות ב 5 מ"ל לסמן ולמחוק את החצי העליון. צינורות יכול להיות מכוסה parafilm או כובע עם צינור תוך הגדרת. באמצעות צינור microfuge מתלה, צינור עמדה כל כך את החללית sonicator יושב כ 0.5-1.0 ס"מ מעל החלק התחתון של הצינור. תשמרי על עצמך כי בדיקה ממוקדת ולא לפנות את הצדדים של הצינור. (המיקום יכול להשפיע על בדיקה אם קצף פתרון או לא במהלך sonication. בדרך כלל, קצף עולה כי ה-DNA sonicated יהיה טעון היטב.) Sonicate ההשעיה 6 פעמים במהלך 20 שניות דוגמאות יש לשמור באמבט קרח מים במהלך sonication. כדי להקטין קצף, הגדר תחילה כוח פלט 0 ולהגדיל באופן ידני לשלטון הסופי במהלך התפרצות ראשונה. (אם יש הקצפה משמעותי, כל הבועות ניתן להסיר על ידי צנטריפוגה ב g 20,000 ואחריו resuspension עדין של כל חומר, לא משאירים בועות קצף). ספין על g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C עד פסולת גלולה ולאסוף את supernatant בצינור 1.5 מ"ל. שמור 50 μl של תאים lysate מכל מדגם כמו ה-DNA קלט. חנות ב -20 ° C. לפחות אחד DNA aliquot קלט צריך להישמר לכל אצווה של lysate sonicate. ראוי לציין, כי תופעות של השפעות sonication ואת ההפצה כתוצאה בגדלים שבר יכול להיות רק בדק לאחר היפוך crosslink וטיהור של ה-DNA. הכרומטין immunoprecipitation מוסיפים את כמות הכרומטין, המקבילה של 5 x אוקטובר 07-01 x 10 8 תאים sonication Cell, שלב 4 כדי לערבב 50 נוגדנים / מגנטי μl חרוז מתוך הכנת חרוזים מגנטיים, שלב 6 עם נפח סופי של 1 מ"ל (זה יכול להיות ניתן להתאים עם הצפת תמוגה, אם בכלל). דגירה לילה על הכתף ב 4 ° C. לשטוף איסוף חרוזים באמצעות Dynal MPC. המקום צינורות מתלה. אפשר לאסוף חרוזים בצד של הצינור. זה צריך לקחת כ 20 שניות היפוך מתלה פעמיים כדי לעזור לאסוף את כל החרוזים. הסר supernatant עם pipettor, שינוי עצות בין דגימות. הוסף 1 מ"ל תמוגה הצפת אל צינור כל וחרוזים resuspend בעדינות. ניתן לעשות זאת על ידי הסרת פס מגנטי מהמדף מתלה היפוך, עם צינורות עדיין במקום – 10-20 פעמים או עד חרוזים הם resuspended שווה. איסוף חרוזים. הסר supernatant ידי pipettor. חזור על לשטוף 5 פעמים יותר, שינוי עצות בין שוטף. לשטוף חרוזים 6 פעמים הצפת 1 IP1 מ"ל, כפי שמתואר בשלב 2. לשטוף חרוזים 6 פעמים הצפת 1 IP2 מ"ל, כפי שמתואר בשלב 2. לשטוף חרוזים 6 פעמים ב 1 מ"ל הצפת 8.0 TE, כפי שמתואר בשלב 2. ספין על 960g 3 דקות ב 4 ° C ו להסיר כל חוצץ שיורית TE. Elution הוסף μl 210 של הצפת elution חומר elute מתוך חרוזים על ידי דוגרים צינורות אמבטיה 65 מעלות צלזיוס מים במשך 15 דקות. וורטקס בקצרה כל 2 דקות. הדגירה זה יכול להתארך עוד 30 דקות, אשר יכול לעזור לשפר את ההתאוששות של eluate. ספין למטה חרוזים ב g 16,000 1 דקות בטמפרטורת החדר. הסר 200 μl של supernatant ולהעביר צינור חדש. חומר יכול להיות קפוא ב -20 ° C ו מאוחסן לילה. Crosslink היפוך הפוך crosslink את ה-DNA immunoprecipitation משלב elution, 3 על ידי דוגרים על 65 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 6 שעות ועד למקסימום של 15 שעות (פעמים יותר היפוך crosslink בדרך כלל תוצאה של רעש מוגבר בניתוח microarray). הדגירה ניתן לעשות זאת בתנור, כך צינור מחומם באופן שווה ויש פחות נוצר עיבוי. הפשירי 50 μl של ה-DNA קלט שמורות לאחר sonication (שלב 13), להוסיף 150 μl (3 כרכים) של חיץ elution ומערבבים. הפוך crosslink זה DNA קלט על ידי דוגרים על 65 ° C כמו היפוך Crosslink, שלב 1. מנקודה זו, צינור כל immunoprecipitation או דנ"א קלט נחשב צינור מדגם נפרד או עיבוד מאוחר יותר שלבים. טיהור DNA הוסף 8 μl של 10 מ"ג מ"ל RNaseA-1 (0.2 מ"ג מ"ל ריכוז-1 גמר), תערובת של פעמים את הצינור היפוך מספר לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ח הוסף 4 μl של 20 מ"ג מ"ל-1 proteinase K (0.2 מיקרוגרם-1 מ"ל ריכוז סופי) ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים לדגור על 55 מעלות צלזיוס למשך 2 ח הוסף 400 μl פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (P: C: IA), מערבולת שלבי נפרד עם 2 מ"ל צינור Phaselock כבדים (פעל בהתאם להוראות הניתנים על ידי Eppendorf). אם P: C: פתרון IA ישן או ב-pH נמוך, יהיו degradation של ה-DNA, גרימת רעש בניתוח הפסד microarray של זיהוי של מטרות חוקיות. העברת שכבה מימית כדי צינור צנטריפוגה חדשה המכילה 16 μl NaCl של 5M (200 mM) בריכוז סופי) ו 1.5 μl של μ 20 μl-1 הגליקוגן (30 בסך הכל מיקרוגרם). הוסף 800 μl EtOH. דגירה של לילה ב -20 ° C או 30 דקות ב -80 ° C. ספין על g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה DNA. לשטוף כדורי על ידי הוספת 500 μl של EtOH 80%, vortexing כדי resuspend גלולה ו ספינינג שוב גרם 20,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C. הסר את כל EtOH 80% הנותרים. ספין צינורות בקצרה לאסוף כל נוזל הנותר ולהסיר נוזלי עם pipetteman, הימנעות גלולה. בואו צינורות אוויר יבש עד יבש כדורי הם פשוט: כדורי עדיין צריך לשמור על מראה רטוב. Resuspend כל גלולה של 70 μl של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0. Overdrying של כדורי אלה יכול לגרום להם קשה resuspend, או עלול פתית ו לקלף מהצד של הצינור. אופציונלי: שמור 15 μl של המדגם immunoprecipitation לשימוש עתידי. חומר זה ניתן להשתמש כדי לבצע גנים ספציפיים אישור ה-PCR של תוצאות microarray. לכמת ריכוז ידי ספיגת UV (260 ננומטר). הערה: השלבים הבאים כולל הכנה ספריה הגברה להשתמש GenomePLex שונה WGA ערכת מערבבים עם מגבר 10X מבית Sigma ללא dNTPs: ספריית הכנה זמין בערכת GenomePLex WGA עם מיקס Amp 10X מ סיגמא הוסף 2 μl של הצפת 1X הכנה ספריית כדי μl 10 של דגימת DNA-DNA טיהור, שלב 11 בצינור PCR. הוסף 1 μl של פתרון ייצוב הספרייה. וורטקס ביסודיות, לגבש ידי צנטריפוגה, ומניחים Cycler תרמית על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מגניב המדגם על הקרח, לגבש ידי צנטריפוגה ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן לחזור קרח. הוסף 1 μl של אנזימים הכנה ספריה, המערבולת ביסודיות ולאחר מכן צנטריפוגות בקצרה. מדגם מקום Cycler דגירה תרמי כדלקמן: 16 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות 24 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות 4 ° C להחזיק הסר דגימות Cycler תרמי בקצרה צנטריפוגות. דוגמאות ניתן מוגבר באופן מיידי או מאוחסנים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. הגברה זמין בערכת GenomePLex WGA עם מיקס Amp 10X מ סיגמא לערבב מאסטר מוכן על ידי הוספת חומרים כימיים הבאים תגובה 15 μl של שלב 3, להלן: 7.5 μl של מיקס Amp 10X (ללא dNTPs) 5.0 μl של פולימראז ה-DNA של WGA 3.0 μl של 10 mM dNTP (כל אחד) מניות (הריכוז הסופי 0.4 mM) תביאו נפח תגובה הסופי μl 75 עם מים nuclease חינם וורטקס ביסודיות. צנטריפוגה בקצרה, ולהתחיל thermocycling. Denaturation ראשוני 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות בצעו 14 מחזורים כדלקמן: לפגל 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות לחשל / הארך 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לאחר רכיבה על אופניים היא מוחלטת, לשמור על תגובות ב 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -20 ° C עד מוכן לניתוח או טיהור. לטהר את ה-DNA עם טיהור PCR ® קיט מ Quiagen על פי הוראות היצרן ולכמת ריכוז ידי ספיגת UV (260 ננומטר). בצע שוב מחזור של הגברה של הכנה ספריה, שלב 1 באמצעות הגברה, שלב 2, עם ההתאמות הבאות. • לגבי כמות ה-DNA הנדרש שלב 3, לעיל, כדי ליזום את תהליך הפיצול: אם ריכוז ה-DNA הוא סביב 200-300 מיקרוגרם / מ"ל, להשתמש 2.5 μl של המדגם ולהתאים עם מים עבור נפח סופי של μl 10. אם ריכוז ה-DNA הוא סביב 50-60 מיקרוגרם / מ"ל, להשתמש 5 μl המדגם ולהתאים עם מים עבור נפח סופי של μl 10. • בתהליך זה הגברה השני, dNTPs עם dTTPs עבור לערבב את המאסטר תמורת שילוב כולל 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP ו 8 מ"מ dTTP ו 2 dUTP mM בריכוז באותו תמהיל הקודם. מדד ה-DNA באמצעות UV מול ספקטרופוטומטר (260 ננומטר). בדרך כלל, יותר מ 9 מיקרוגרם של ה-DNA המוגבר מתקבל כל תגובה. הערה: תיוג של מטרות DNA מתבצע עם GeneChip ® WT פעמיים תקועים בטרמינל DNA Labelling קיט מ Affymetrix על פי הוראות היצרן, כמתואר להלן: קטע מטרות מוגבר שבר את הדגימות באמצעות שולחן המתאים להלן תלוי מה סוג מערך היעד תהיה היברידיתized אל. טבלה 1. פיצול Mix עבור מערכים יחיד רכיב נפח / הסכום Rxn 1 פעמיים תקועים DNA 7.5 מיקרוגרם 10X פיצול cDNA 4.8 μl UDG, 10 U / μl 1.5 μl APE 1, 100 U / μl 2.25 μl Nuclease ללא מים עד μl 48 זמין ® GeneChip WT פעמיים תקועים ערכת Terminal Labelling דנ"א Affymetrix טבלה 2. פיצול Mix עבור רב מערך סטים רכיב נפח / הסכום Rxn 1 פעמיים תקועים DNA 9 מיקרוגרם 10X פיצול cDNA 4.8 μl UDG, 10 U / μl 1.5 μl APE 1, 100 U / μl 2.25 μl Nuclease ללא מים עד 48 זמין ® GeneChip WT פעמיים תקועים ערכת Terminal Labelling דנ"א Affymetrix הגדרת תמהיל פיצול או על פי טבלאות לעיל. פליק, לערבב ספין את הצינורות. דגירה התגובות ב: 37 ° C עבור 1 ח 93 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לפחות. פליק, לערבב, לטוות את הצינורות, ולהעביר 45 μl של המדגם לצינור חדש. הסר 2 μl של כל דגימה לניתוח ג'ל-Shift. מקוטעת תווית פעמיים תקועים DNA הכן את פעמיים תקועים Labelling DNA מערבבים כפי שמתואר בטבלה שלהלן: לוח 3. הרכב מערבבים פעמיים תקועים Labelling DNA רכיב נפח / הסכום Rxn 1 TdT 5X הצפת 12 μl TdT 2 μl ה-DNA מגיב Labelling, 5 מ"מ 1 μl סה"כ נפח 15 μl זמין ® GeneChip WT פעמיים תקועים ערכת Terminal Labelling דנ"א Affymetrix הוסף 15 μl של מיקס פעמיים תקועים סימון ה-DNA של דגימות DNA, קפיצי לערבב ספין אותם. דגירה התגובות ב: 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. 4 ° C דקות לפחות 2. הסר 2 μl של כל דגימה לניתוח ג'ל-Shift. Gel-Shift ניתוח הכן ג'ל 4% agarose. דגירה דגימות מטרות שבר מוגבר, שלב 5 ו מקוטעת תווית פעמיים תקועים DNA, שלב 4 ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. הוסף 10 μl של streptavidin (1 מ"ג / מ"ל), דגימות דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הפעל דגימות שלב 3 על 4% agarose ג'ל (Gel-Shift ניתוח, שלב 1) כדי לבדוק את ההגירה משמרת של המוצרים תיוג. מערך הכלאה & Array כביסה הנערכת על ידי מרכז הגנום של אוניברסיטת קליפורניה בריברסייד. מערך ניתוח בביצוע ניתוח חישובית. חיץ קומפוזיציות: בלוק פתרון: PBS + 0.5% שור סרום אלבומין (BSA). מאגר תמוגה: 50 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5 140 mM NaCl 1 mM EDTA טריטון 1% X-100 0.1% SDS 1mm PMSF גמר ה-pH 7.5 IP1: מאגר תמוגה + 500 mM NaCl IP2: 10 mM טריס-HCl 250 מ"מ LiCl 1 mM EDTA 0.5% NP-40 נתרן 0.5% Dioxycholat גמר ה-pH 8.0 TE: 10 mM טריס, pH 7.4 1 mM EDTA גמר ה-pH 8.0 Elution הצפת: TE הצפת + 1% SDS.