Schritt 1: Auftauen 293-Zellen und die Platte für Lentivirus Produktion. Bereiten 9 ml DMEM + Medium in einer 15-ml-Tube. Nehmen Sie ein Fläschchen eingefroren 293 Aktien aus dem flüssigen Stickstoff-Tank und steckte die Flasche in einem 37 ° C Wasserbad, bis die meisten (aber nicht alle) Zellen aufgetaut werden. Entfernen Zellen vor dem Einfrieren Fläschchen und Ort in die 15ml Tube aus Schritt 1. Zentrifugation bei 180g für 5 min, und dann den Überstand verwerfen. Resuspendieren der Zellen mit 10 ml DMEM + Medium, und in ein mit Gelatine beschichtete 100-mm-Schale. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator bis sie 80-90% konfluent sind. Passage des 293-Zellen: Zellen mit PBS waschen, saugen Sie den PBS und 4 ml pro 10-cm-Spiegel von 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA und Inkubation für 1 min bei 37 ° C. Lösen Sie Zellen aus Gerichten, indem Sie mit 10 ml DMEM + Medium resuspendieren und Transfer zu einem 15-ml-Tube. Zentrifugation bei 180g für 5 min, und saugen Sie den Überstand. Add entsprechenden Volumen DMEM + Medium und die Zellen aufzubrechen zu einer einzigen Zelle Suspension durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 8×10 5 Zellen pro ml mit FP-Medium. Seed-Zellen bei 8×10 6 Zellen (10 ml) pro 100-mm Kulturschale, und bei 37 ° C über Nacht, 5% CO 2. Schritt 2: Transfizieren 293 Zellen mit Lentiviren Plasmide und Ernte-Virus Für jeden 10-cm-Platte, verwenden 10 ug FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 oder c-Myc) Lentivirus Backbone mit 2.5ug der PMD-G und 7,5 ug pPax2. Während Aliquotierung der drei Plasmide in ein Rohr, liefern 30μl der Fugene 6 Transfektionsreagenz in ein zweites Röhrchen mit 500μl DMEM ohne Serum und vorsichtig mischen mit dem Finger tippen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie die DNA-Mix Drop-by-drop in die Fugene 6/DMEM-containing Rohr, mischen Sie durch Fingertapping und Inkubation für 20 min. Fügen Sie die DNA / Fugene 6-Komplex tropfenweise in die Schüssel von 293 ist, beimpft und über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. Am nächsten Morgen: Saugen Sie das Transfektionsreagenz-haltigem Medium, 5 ml frischem ES-Zell-Medium, und kehren die Zellen in den Inkubator. Nach 48 Stunden und 72 Stunden nach der Transfektion, sammeln das Medium von den 293 ist mit einem 10-ml sterilen Einwegspritze, Filtrieren durch ein 0,45-um Porengröße Celluloseacetat-Filter, und die Übertragung in einen 15-ml-Tube. Konzentrieren Sie sich die Virus-Überstand durch Ultrazentrifugation. Resuspendieren Viruspellet in gewünschte Lautstärke und stellen ein Gemisch von gleichen Teilen aus dem Medium, das Oct-3/4-, Sox2-, Klf4 und c-Myc-Lentiviren. Während der Arbeit an dem Virus, bereiten Oct4-neo/rtTA oder Oct4-GFP/rtTA MEFs (Durchgang <3) bis 90% Konfluenz in 10-cm-Schalen (2×10 6 Zellen pro Schale) Absaugen des Kulturmediums und Waschen mit 10 ml PBS. Discard PBS, 1 ml pro Schale von 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, und bei 37 ° C für 10 min. Add 9 ml des Kulturmediums, Aussetzung der Zellen zu einer einzigen Zelle, und in ein 15-ml-Tube. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, und passen Sie die Konzentration auf 8×10 4 Zellen pro ml. Transfer 10 ml Zellsuspension (8×10 5 Zellen) zu einer 10-cm-Spiegel mit Gelatine beschichtet. Inkubieren Sie die Schüssel über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. Saugen Sie das Medium aus Fibroblasten Schüssel und fügen Sie 10 ml des Virus-haltigem Medium. Inkubieren Sie die Zellen von 4 h bis über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. Nach 24 Saugen Sie das Medium aus Fibroblasten Schüssel, und mit 10 ml frischem ES-Zell-Medium. Ersetzt einen regulären ES-Zell-Medium mit Medium mit Doxycyclin die Expression der vier Gene initiieren, mit anderen Worten, zu initiieren Neuprogrammierung. Bei Verwendung eines Oct4-neo-Reporter, dann starten Medikament Abschnitt jederzeit zwischen 6 und 9 Tagen. Ändern Sie das Medium jeden Tag, bis die Kolonien groß genug, um abgeholt zu werden. Kolonien sollten zuerst sichtbar werden etwa eine Woche nach Beginn der Umprogrammierung. Sie sollten groß genug, um bis etwa Tag 20 abgeholt werden. Schritt 3: Picking up the iPS Kolonien Am Tag vor Picking: Seed die erforderliche Anzahl von Gelatine beschichtete 24-Well-Platten mit γ-bestrahlten DR4 MEFs Picking Clones an Tag 1: Feed the Kolonien auf den Platten 1-2 Stunden vor Kommissionierung. Add 15 ul PBS in die Vertiefungen eines V-Boden 96-well Schale. Waschen Sie die Schale mit den Kolonien, einmal mit PBS aufgenommen und fügen Sie 10 ml PBS in die Schale. Wählen Sie die Kolonien mit dem kleinen 5μl Pipettenspitzen (stellen Sie den P20 Pipetman auf 4 ul). Transfer-colonies zu einem Brunnen in der 96-well Schale. Add 20 ul Trypsin in jede Vertiefung mit dem Multi-Channel-(12) pipetor. Pipet nach oben und unten 3 mal. Bei 37 ° C für 4 Minuten. 100 l von ES Medium, um die trypsiniert Kolonien. Pipet nach oben und unten 10-mal. Transfer-6 Klone in einer Zeit, aus dem 96-Loch-Spiegel auf eine 24-Well-Schale mit einer Spitze an jedem anderen Position auf den 12 Platz pipetor. Wachsen die Zellen auf der 24-Well-Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator bis die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen, Fütterung täglich mit ES-Zell-Medium. Cells dürfte bereit sein, innerhalb von 3-7 Tagen zu erweitern. Schritt 4 Ausbau der iPS-Zellen Saugen Sie das Medium, und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS. Entfernen PBS vollständig, fügen Sie 0,1 ml 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 10 min. Fügen Sie 0,4 ml der ES-Medium und setzt die Zellen durch Auf-und Abpipettieren, einzelne Zell-Suspension. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung 6-Well-Platte, 1,5 ml ES-Zell-Medium und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator bis die Zellen zu erreichen 80-90% Konfluenz in 6-well Platten. An dieser Stelle vorzubereiten eingefroren Lager der Zellen, wie folgt. Vorbereitung von freeze Lager Saugen Sie das Medium, und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS. Entfernen PBS vollständig, 0,5 ml 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 10 min. 2 ml des ES-Medium und setzt die Zellen durch Auf-und Abpipettieren, einzelne Zell-Suspension. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15-ml-Tube, die Anzahl von Zellen und Spin-down der Zellen. Überstand verwerfen, resuspendieren Sie die Zellen mit ES-Medium, um die Konzentration auf 2×10 6 Zellen pro ml. Bereiten Sie 2 ES-Zelle Einfriermedium (20% DMSO in ES-Medium) und aliquote es bei 0,5 ml pro Fläschchen. Übertragen 0,5 ml der Zellsuspension Fläschchen einfrieren und vorsichtig mischen. Legen Sie die Flaschen in einer Zelle-Gefrierbehälter und halten Sie sie bei -80 ° C über Nacht; in flüssigen Stickstoff Transfer am nächsten Tag für eine langfristige Lagerung.
