このプロトコールは、顕微手術を通じて発生中のゼブラフィッシュの心臓に磁気ビーズを移植する方法を概説し、 生体内で の機械的な力の操作を可能にし、心内膜細胞への機械的刺激依存的なカルシウム流入を誘発します。
機械的な力は、心臓弁の形態形成プログラムにフィードバックを継続的に提供します。ゼブラフィッシュでは、心臓弁の発達は、心臓の収縮と心臓の鼓動によって生成される物理的刺激に依存しています。血流によって駆動される心臓内血行動態は、胚の心臓の発達を形作る基本的な情報として浮かび上がってきます。ここでは、直径30μmから60μmの磁気ビーズを心内腔にグラフトすることにより、 生体内で 機械的な力を操作する効果的な方法について述べます。ビーズの挿入は、心臓の機能を乱すことなく麻酔をかけた幼虫のマイクロサージェリーによって行われ、境界条件の人為的な変更を可能にし、それによってシステム内の流れの力を変更します。その結果、ビーズの存在は心内膜細胞が経験する機械的な力を増幅し、機械的刺激依存性のカルシウム流入を直接引き起こす可能性があります。このアプローチは、心臓の発達を支配する機械伝達経路の調査を容易にし、心臓弁の形態形成における機械的な力の役割についての洞察を提供することができます。
1970年代後半に導入されて以来、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、心臓の発達と先天性心疾患の複雑さを研究するための強力なモデルシステムとして浮上してきました。マウスやニワトリの胚を含むほとんどの脊椎動物は、機能的な心血管系に依存しており、初期の心臓の欠陥を乗り越えることができませんが、ゼブラフィッシュは、重度の心臓表現型の調査を可能にするという独自の利点を提供します。これは、そのサイズが小さいため、受動的な拡散によって十分な酸素供給が促進され、心臓の収縮や活発な血液循環がなくても生存できるためです2,3,4。さらに、ゼブラフィッシュの多くの重要な特徴の中には、その胚の光学的透明性があり、これにより発達中の心臓5,6,7,8の非侵襲的なモニタリングが可能になります。
機械的な力は、心臓弁の形態形成プログラム9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22にフィードバックを連続的に提供します、そして異常な血流は、さまざまな心血管障害23,24の共通の要因として広く認識されています。ゼブラフィッシュでは、心臓弁の発達は心臓の収縮と心臓の鼓動によって生成される機械的な力に依存しています。複数のゼブラフィッシュの変異体が、心臓が生成する機械的刺激が弁膜形成に重要であることを実証しています。驚くべきことに、無症状の心臓(sih)変異体における心臓の収縮と、その結果としての心筋トロポニンT(tnnt2)の突然変異による血流の完全な欠如は、初期の形態形成段階での組織収束と心内膜細胞(EdC)のクラスタリングの欠如をもたらす25。
心臓内の血行動態と血流によって生成される機械的な力は、ゼブラフィッシュの胚心の発達を形作る基本的なエピジェネティックな要素として現れます。ゼブラフィッシュの適切な心臓形態形成には明確な流れ刺激が必要であり、これらの生理学的パターンからの逸脱が心臓弁の欠損につながることが多くの研究で示唆されています10,13,14,22,26。ここでは、Fukui et al.13から採用された、発達中のゼブラフィッシュの鼓動心臓内に直径30 μmから60 μmの磁気ビーズをグラフトすることにより、生体内で機械的な力を操作する効果的な方法について説明します。この技術では、麻酔をかけた幼虫の心臓内腔にビーズをマイクロサージェリー挿入し、心臓機能を乱すことなく挿入します。ビーズの存在は、EdCが経験する機械的な力の増幅につながり、機械的刺激依存性のカルシウム流入を直接引き起こす13。このアプローチにより、心臓の形態形成を制御する機械伝達経路の調査が可能になり、弁形成における機械的な力の役割についての理解を深める手段が提供されます。
プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ
ゼブラフィッシュ胚のマウント
胚をマウントするために使用されるアガロースの量は重要です。形成されるドームは、表面から胚へのビーズの操作を妨げる可能性があるため、過度に大きくしてはいけません。逆に、小さすぎてはいけ?…
The authors have nothing to disclose.
このプロトコルに関する議論とコメントをいただいたVermot研究室のメンバーに感謝いたします。インペリアル・カレッジ・ロンドンの魚類施設のスタッフの皆様に感謝申し上げます。このプロジェクトは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラム(GA N°682939、Additional Ventures(受賞番号1019496)、MRC(MR/X019837/1)、BBSRC(BB/Y00566X/1)に基づき、欧州研究会議(ERC)から資金提供を受けています。CV-Pは、バイオエンジニアリング学部奨学金(インペリアルカレッジロンドン)によって支援されました。HFは、日本学術振興会科研究費補助金(23H04726、24K02207)、JST FORESTプログラム(23719210)、上原記念財団、細胞科学研究財団、武田医学研究財団、ノバルティス研究財団の支援を受けました。
Materials | |||
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection | |||
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
Heat block | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
Jewelers forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy |
Microcentrifuge tubes 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
Pasteur pipette | |||
Petri dish | |||
Stereomicroscope | |||
Reagents | |||
4 mg/mL tricaine stock solution | |||
Danieau's medium (60x stock solution) | |||
PureCube Glutathione MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
Danieau's medium (60x stock solution) | |||
34.8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
1.6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
5.8 g CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
9.78 g MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave. | |||
4 mg/mL tricaine stock solution | |||
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
97.9 mL double-distilled H2O | |||
2.1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C. |