ここで紹介するプロトコールは、ショ糖密度勾配遠心分離により 、シロイヌナズナからトランス ラトーム、リボソームに関連するmRNAを非ポリソームおよびポリソームRNAに単離するためのポリソームプロファイリングを含みます。この方法は、熱ストレスを受けた シロイヌナズナの翻訳効率を示しています。
熱ストレス下での異なる遺伝子の翻訳制御は、植物が環境に適応するための重要なステップです。さまざまな遺伝子の翻訳活性を評価することは、植物のレジリエンスを支える分子メカニズムを理解するのに役立ち、地球規模の気候変動に直面してもストレス耐性が強化された作物の開発に貢献します。この論文では、熱ストレスにさらされた植物におけるポリソームプロファイリングによる翻訳効率を評価するための詳細な方法論を紹介します。 手順は、シロイヌナズナの熱ストレス治療、ポリソームプロファイルを用いた翻訳効率試験、プロファイルに基づく非ポリソームRNAとポリソームRNAを単離することによる翻訳効率の計算の3つに分かれています。最初の部分では、 シロイヌナズ ナの植物は、環境の課題を模倣するために制御された熱ストレス条件にさらされます。この処理には、植物を指定された時間高温にさらすことが含まれ、一貫性と再現性のある応力誘導が保証されます。このステップは、熱ストレスに対する植物の生理学的および分子的応答を研究するために重要です。第2部では、ポリソームプロファイリングを用いた翻訳効率試験を行います。ポリソームは、リボソーム負荷に基づいてmRNAを分離するショ糖勾配遠心分離によって抽出されます。これにより、mRNA上のリボソーム占有率を調べることができ、ストレス条件下での翻訳制御メカニズムに関する洞察が得られます。第3部では、RNAはポリソーム画分と非ポリソーム画分の両方から単離されます。スパイクインRNAは、各画分中のRNAの量を正確に測定するために使用されます。翻訳効率の計算は、通常のストレス条件と熱ストレス条件下でこれらの画分にわたるmRNAの分布を比較することによって実行されます。特定の遺伝子の翻訳活性は、リボソーム関連RNAおよび全RNAを用いた定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行うことにより、さらに評価されます。この方法論は、熱ストレスの影響にのみ焦点を当てており、植物の翻訳調節を分析するための詳細なプロトコルを提供します。
翻訳は、生物がmRNAから機能的なタンパク質を合成し、代謝やシグナル伝達などの重要な細胞機能や生物学的プロセスをサポートし、ストレス応答を可能にするために重要です。翻訳がなければ、細胞は重要なタンパク質を産生することができず、その構造、機能、および調節に影響を与え、それによって生命の維持と生物学的多様性の育成に影響を及ぼします1,2。したがって、植物の並進効率を研究することは非常に重要です。翻訳には、いくつかの重要なステップがあります。まず、開始はmRNAがリボソームに結合するときに起こり、真核生物のeIFなどの開始因子によって促進され、開始コドン(通常はAUG)が識別されます。次に、それぞれが特定のアミノ酸を持つトランスファーRNA(tRNA)分子がリボソームに順次結合することで伸長が進行します。ペプチド結合は隣接するアミノ酸間に形成され、mRNA配列に従ってポリペプチド鎖を伸長します。最後に、リボソームに新しく合成されたタンパク質を放出するように促す放出因子によって認識される停止コドン(UAA、UAG、またはUGA)に遭遇すると、終了が開始されます。翻訳全体を通じて、さまざまな真核生物の開始因子(eIF)、伸長因子、およびリボソームRNAが連携して、精度と効率を確保します3,4。
これまでの研究では、翻訳後修飾がeIF間の相互作用の制御に重要な役割を果たし、それによって翻訳効率に影響を与えることが示されています。In vitroでの研究では、カゼインキナーゼ2(CK2)キナーゼがeIF3c、eIF5、およびeIF2βをリン酸化して、eIF1 5,6との相互作用を増加させることが明らかになりました。暗所では、E3リガーゼCONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1(COP1)は、S6K-RPS6のTOR媒介リン酸化を阻害することにより翻訳を抑制します。非リン酸化RPS6は機能的なリボソームを形成することができず、したがって翻訳7を停止する。逆に、光条件下では、SUPPRESSOR OF PHYA 105(SPA1)キナーゼはeIF2αをリン酸化してeIF2複合体の組み立てを促進し、翻訳開始を促進します8。この知見は、環境シグナルに応答して翻訳を調節する複雑な制御機構を明らかにしている。
適度な環境刺激は、光形態形成8,9などの成長を促進するための翻訳プロセスを効果的に促進することができます。しかし、環境要因が過剰である場合、不動の植物は、環境ストレスによって引き起こされる損傷を軽減するための適切な調節メカニズムを進化させる必要がある10。植物のストレス応答に関連する以前の研究では、大多数は代謝、ホルモン、および転写レベルでの調節に焦点を当てていました11,12,13,14。しかし、最近の研究では、トランスレーショナルレギュレーションが植物のストレス耐性に及ぼす影響が強調され始めています15,16,17。植物は、並進効率を低下させることでストレス耐性を高め、それによって不要なエネルギー消費を最小限に抑えることができます。植物細胞における非膜性ストレス顆粒の形成により、未翻訳のmRNAおよび関連タンパク質がそれらの中に凝集し、翻訳効率を低下させる18。植物がしばしば遭遇する一般的な環境ストレスの1つは、植物細胞内のストレス顆粒の形成を誘発することが報告されている熱ストレスである19,20。地球温暖化による地球平均気温の上昇は、作物の収穫量に深刻な影響を及ぼします21。そのため、熱ストレス下での植物の生理制御を研究することは非常に重要です。これまでの研究では、コムギの加熱処理によりポリソーム結合mRNAが減少することが分かっています。しかし、ストレス顆粒に保存されたmRNAは放出され、リボソームに再結合し、回復後の翻訳を促進した22。さらに、以前の研究では、水没した植物における全mRNAとポリソーム結合mRNAとの間の遺伝子発現が比較されている16。その結果、アブシジン酸および非生物的ストレス応答に関連するmRNAの定常状態レベルが、潜水後にわずかに増加することが示されました。さらに、ポリソーム結合mRNAの量が有意に増加しました。これらの結果は、翻訳調節が植物のストレス耐性を制御する上でより重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。したがって、ストレス処理されたサンプルのトランスラトームを研究するためには、効果的なポリソームRNA単離法が重要です。
このプロトコールでは、RNA単離法を、LiCl沈殿法による高リスクで大量のフェノール/クロロホルム抽出法から、必要な量が少ない小規模フェノール/グアニジンチオシアン酸抽出法に変更しました。前者の方法は、ポリソーム画分と直接混合することを含み、その結果、より大きな実験廃棄物9,15,23が生じる。対照的に、この修正されたアプローチは、密度差の原理を利用しています:ポリソームRNAは、最初に高塩の無糖溶液と混合され、次に超遠心分離によって沈殿されます。続いて、少量のフェノール/グアニジンチオシアン酸試薬を用いてRNA抽出を行います。この方法により、有機性廃棄物の発生を効果的に削減し、私たちの実験をより環境に優しいものにします。さらに、使用される有機溶剤は毒性が低くなっています。これらの理由から、私たちはそれに応じて実験手順を調整し、改善することになりました。さらに、以前の方法では、より詳細な経原子解析に不可欠なスパイクイン正規化を使用して翻訳効率を計算するための包括的なプロトコルが提供されていませんでした。
ここでは、熱ショックストレス下での シロイヌナズ ナの翻訳効率と経原子解析を調べるためのポリソームプロファイリングとポリソームRNA単離プロトコールについて説明します。このプロトコルは、正常、熱ショック、および回復後の条件下でのCol-0野生型の翻訳効率を評価するために採用されました。ポリソームプロファイリングの結果とポリソームRNAの割合から、 シロイヌナズ ナの実生における熱ストレス処理後の翻訳効率の変化が明らかになった。
このプロトコルは、シロイヌナズナの実生の翻訳効率を測定するための簡単で標準化された方法の概要を示しています。このプロトコルの重要なステップは、二次遠心分離とRNA抽出試薬抽出によるRNAの安定性の確保、およびスクロース勾配の綿密な調製です。さらに、スパイクイン正規化法により、非ポリソームおよびポリソームRNAを標準化および定量するための重…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、国立台湾大学(台湾)の科学技術部が後援する生命科学部のテクノロジーコモンズと計装センターからの超遠心分離技術研究サービスに感謝します。また、技術サポートを提供してくださったYu-Ling Liang氏と、原稿を批判的に読んでくださったCheng研究室のメンバーにも感謝します。この研究は、台湾の国家科学技術評議会のYoung Scholar Fellowship Einstein Programによって助成されました。NSTC 113-2636-B-002-007 から M.-C.C.M.-C.C.は、国立台湾大学からの財政的支援に感謝しています。
1.5 mL eppendorf tube | Labcon | 3012-870-000-9 | RNA extraction |
13.2 mL centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | ultracentrifugation |
Bromophenol blue | Honeywell | 32712 | Polysome profile |
Chloroform | Honeywell | 32211 | RNA extraction |
Cycloheximide (CHX) | Sigma-Aldrich | SI-C7698 | Polysome profile |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | RNA extraction |
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit | Invitrogen | 900433 | Normalization |
Glycerol | Honeywell | 15523 | Normalization |
Heparin | Sigma-Aldrich | SI-H3149 | Polysome profile |
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit | Vazyme | R323-01 | Normalization |
KCl | J.T.Baker | 3040-01 | Polysome profile |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | SI-M8266 | Polysome profile |
MS basal medium | Phyto | M524 | Plant culture |
Peak Chart Syringe Pump | Brandel | SYN4007LS | Polysome profile |
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE) | Sigma-Aldrich | P2393 | Polysome profile |
RNasin | Promega | N251B | Polysome profile |
Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | SI-D6750 | Polysome profile |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5391 | Polysome profile |
SYBR Green Supermix | Bio-Rad | BP170-8882 | Normalization |
TRI reagent | MRC | TR118 | RNA extraction |
Tris-HCl | J.T.Baker | 4109-06 | Polysome profile |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100K | ultracentrifugation |
UV/VISDETECTOR | Brandel | UA-6 | Polysome profile |