概要

Nicotiana benthamianaにおけるPlasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析

Published: November 01, 2024
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概要

このプロトコルは、ウイルス-プラスモデスマタ相互作用またはプラスモデマーム輸送中にプラスモデスマタを標的とするタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のための最適なプラスモデスママーカーの選択を説明しています。

Abstract

Plasmodesmataは、隣接する植物細胞の細胞質をつなぎ、栄養素、高分子、侵入ウイルスの細胞間輸送を可能にする膜状のナノポアです。Plasmodesmataは、細胞間コミュニケーションの調節において基本的な役割を果たし、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用に貢献します。植物やウイルスのタンパク質の体質形成部局在を発見することは、タンパク質に関する有用な機能情報を提供する可能性があり、植物とウイルスの相互作用のメカニズムを理解するために重要です。これらの研究を容易にするために、ウイルス-プラスモデスマタの相互作用またはプラスモデスマの輸送を研究するための最適なプラスモードマーカーを選択するために、さまざまなプラスモードターゲティングタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のプロトコルについて説明します。具体的には、これらの事象の解析は、 カブ静脈透明化ウイルス (TVCV)、 シロイヌナズナPlasmodesmata-Localized Protein 5(PDLP5)、およびPlasmodesmata Callose-Binding Protein 1(PDCB1)の細胞間移動タンパク質(MP)を用いて示されています。タンパク質の体質形成局在データは、サンプリングされた組織のアニリンブルー染色を使用して、体質形成体の全体的な可視化と並行して分析されます。これらのアプローチは、プランタ内の任意の細胞タンパク質または病原体タンパク質の体質形成局在を分析するために容易に適応できます。

Introduction

Plasmodesmata(PD)は、細胞間コミュニケーションの制御を通じて、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用を制御する上で基本的な役割を果たします1,2。PDは、細胞質分裂中に最初に形成され、2つの娘細胞の間の新しい細胞に数百のPDが挿入され、細胞間コミュニケーションのためのチャネルが供給されます3,4。PDは膜に富む構造であり、原形質膜3,4によって裏打ちされた細孔の中央部分に小胞体(ER)由来の膜であるtrans-PDデスモチューブルが含まれています。比較プロテオミクスアプローチにより、β-1,3-グルカナーゼ(BG)、カロース合成酵素(CALS)、原形質形成タンパク質(PDLP)、カロース結合タンパク質(PDCB)、複数のC2ドメイン膜貫通領域タンパク質(MCTP)3、ロイシンリッチリピート受容体様キナーゼ(RLK)5など、多数のPD機能タンパク質が同定されました。最近、Kirkらはplasmodesmata in silico proteome 1(PIP1)と呼ばれるツールを開発し、22の植物種6における新しいPDタンパク質を予測することを可能にしました。PDは、植物の発生中およびさまざまな応力に対する応答中に、透過性と構造が異なります。PDを取り巻く頸部領域でのカロース(β-1,3-グルカン)の沈着と加水分解は、PD調節の広く知られているメカニズムの1つです7

真菌、細菌、ウイルスを含む多くの病原性微生物は、感染中にPDの拡張または構造を操作することができる2,8,9。イネいもち病の原因物質であるMagnaporthe oryzaeは、細胞内侵襲菌糸を配備してPD8を介して細胞から細胞へと移動します。細菌性病原体Pseudomonas syringae pv.トマトは、PDLP7との相互作用と不安定化を通じて宿主植物内での細胞間移動と拡散のためにエフェクタータンパク質HopO1-1を必要とし、シロイヌナズ9の隣接細胞の分子フラックスを増加させます。しかし、植物ウイルスは、細胞間伝播中のPDの調節においてより汎用性が高く、ウイルス移動タンパク質(MP)は細胞間移動を促進します2。PDは、植物の発育と成長を調節する重要な機能、および植物病原性微生物との相互作用により、近年ますます注目を集めています。シロイヌナズナには、PDLP(1-8)とPDCB(1-5)の2つの主要なタイプのPD機能タンパク質があり、PDLP5 1,10,11、PDLP112、PDLP6 13、PDLP714、PDCB115など、多くのPD機能性タンパク質がカロース沈着の制御を通じてPD透過性を操作する役割を果たしていることがわかった。しかし、一部のPDLPは機能的な冗長性を有することがわかった、例えば、pdlp1およびpdlp1,2のノックアウト変異体は分子輸送に影響を及ぼさなかったが、pdlp1,3およびpdlp2,3のダブルノックアウト変異体は杉形質透過性の増加を示した16。興味深いことに、PDLP5単独のダウンレギュレーション/ノックアウトまたは過剰発現は、それぞれ漿質透過性の増加または減少をもたらします1,17。最近、Liらは、PDLP5とPDLP6が異なる細胞界面で機能することを発見した13。これらの結果は、PDLP5 が他の PDLP と非冗長な機能を持つ可能性があることを示しています。

細胞間コミュニケーションにおけるPDの重要な機能のために、私たちは植物PDタンパク質PDLP5およびPDCB1、および カブ静脈クリアウイルス (TVCV)のウイルス細胞間移動タンパク質(MP)を細胞生物学実験のためのシンプルで便利で信頼性の高いPDマーカーとして展開するためのプロトコルを開発しました。さらなる検証のために、サンプリングした組織のアニリンブルー染色を用いたPDの可視化を並行して進めました。PDLP5、PDCB1、およびTVCV MPのPD局在について記載されているプロトコルは、生きた植物における任意の細胞または病原体由来タンパク質の潜在的なPD局在を分析するために容易に適合させることができます。

Protocol

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。 1.植物の成長 Nicotiana benthamianaの種子を、光16時間、暗闇8時間、23°Cの制御された環境チャンバーの湿った土壌で育てます。 約2週間後、根の周りに泥炭ペレットを巻き付けた苗を大きな鉢に慎重に移し、農業浸透実験のために同じ条件下で4〜5週間成長を続けます。注:花序段階18でGFPの蓄積が減少するため、開花し始めたときに植物を使用しないでください。 2. ベクトル構造 PCRを使用して、Q5 High-Fidelity DNAポリメラーゼで目的のコード配列を増幅し、市販のBP Clonaseキットを使用してBP反応19 によってエントリーベクターpDONR207にクローニングします。 得られたエントリープラスミド中の標的遺伝子を、市販のLR Clonaseキットを用いてLR反応19 により目的ベクターpPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1に移し、EGFPタグを標的タンパク質のC末端に融合させたプラスミドを作製する。 PCRとシーケンシング19によってすべてのコンストラクトを確認します。 3.アグロインフィルトレーション Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105細胞に異なるベクターを含有し、LB寒天プレート上に28°C下で2日間インキュベートしました。 1つのコロニーを2 mLのLBブロスに移し、撹拌(250 rpm)しながら28°Cで一晩インキュベートします。 1 mLを一晩培養し、続いて4 mLの新鮮なLBブロスを加え、同じ条件下で1時間再培養します。 細菌懸濁液をOD600 = 0.1(2つのタンパク質の共発現についてはOD600 = 0.2)に調整し、浸潤バッファー(MgCl2、10 mM;MES、10 mM、pH 5.6)。 異なる細菌懸濁液を1:1(v / v)の比率で混合して、OD600 = 0.1の最終濃度にします。(オプション)。 細菌懸濁液を室温で3時間インキュベートし、柔らかく攪拌します。 1mLの針のない使い捨て注射器で、さまざまな植物から完全に拡張した葉の軸面に浸潤し、浸潤領域(周囲の浸透していない組織よりも暗い色)を防水ペンでマークします。 このプロトコルの共焦点顕微鏡のセクション(ステップ5)に進みます。注:関心のある植物種の形質転換に適した Agrobacterium tumefaciens の他の株も使用できます。 4.アニリンブルーステイン 200 μLの1%アニリンブルー(50 mMリン酸カリウム緩衝液中、pH 8.0)のアリコートを顕微鏡スライド20に加えます。 静脈から約0.5cm×0.5cmの浸潤領域をブレードで切除し、顕微鏡スライド上のアニリンブルー溶液(ア軸面を上にして)に葉組織サンプルを移し、葉組織サンプルがアニリンブルー溶液に浸されていることを確認してから、カバーガラス(22mm×50mm)で覆います。 サンプルを真空ポンプに取り付けたデシケーターに顕微鏡スライドを入れ、2分間(<0.8Pa)排気した後、圧力をゆっくりと解放し、室温で30分間暗所でインキュベートします。 アニリンブルーの蛍光シグナルを、互換性のあるソフトウェアを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡で可視化します。注:ここでは、Huangらによるアニリンブルー染色法20 を使用しました。この技術の修正では、同じ実験を2分間の真空ステップなしで実行し、同様の結果をもたらし、真空乾燥がアニリン染色に必須ではないことを示唆しています。また、アニリンブルーステインの濃度や染色時間は、葉組織の供給源などによって異なる場合があります。 5. 共焦点顕微鏡 浸潤後、異なる時点で2つの植物から2枚の葉を収穫します。浸潤部を刃物で静脈から約0.5cm×0.5cmスライスに切ります。顕微鏡スライドの中央部にある滅菌水(軸面を上にして)に組織サンプルをセットし、気泡を避けながらカバーガラス(22 mm x 50 mm)で覆います。 CFP、GFP、RFP信号の検出のための励起波長がそれぞれ405nm、488nm、561nmであること、検出用の発光フィルタがCFPが410-602nm、EGFPとRFPが400-602nm、ピンホール1AU、マスターゲインが769Vに設定されていることを確認してください。 浸潤後1日、2日後、3日後、5日後、7日後、10日後に、レーザー走査型共焦点顕微鏡と互換性のあるソフトウェアを使用して、浸潤領域の自己蛍光タグの蛍光シグナルを視覚化します。10倍対物レンズとGFPフィルターを使用して蛍光シグナルを持つ細胞を特定し、その後、40倍対物レンズに切り替えて細胞内局在の可視化と画像記録を行います。 各条件について、少なくとも 2 つの独立した生物学的複製を使用して 20 枚の画像を収集します。 細胞の周辺部におけるシグナルの診断的点状外観に基づいて、試験されたタンパク質のPD局在をスコアリングする21,22。注:未知のタンパク質の細胞内局在を検出する場合は、少なくとも3つの植物を使用することをお勧めします。 6. データ分析 フィジーのソフトウェアを使用してチャンネルを分割し、画像にスケールバーを追加して視覚化します。 Fijiのソフトウェアを使用してチャンネルを分割し、各画像の平均グレースケール値を測定し、異なる時点でのGFP(MP、PDCB1、PDLP5の場合)またはCFP(アニリンブルー染色の場合)の蛍光強度を評価します。 フィジーのソフトウェアを使用して、GFP(MP、PDCB1、PDLP5用)またはCFP(アニリンブルー染色用)の画像を正規化する前にチャンネルを分割します。画像の面積を測定し、PD点を手動でカウントしました。100μm2あたりのPD点の数を計算しました。 テューキーの多重比較検定23 で二元配置ANOVAを使用して、統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアで異なるサンプルと異なる時点の間の P値を決定します。注:単一チャネル蛍光画像の場合、各ピクセルのグレースケール値は、その点24の蛍光強度を表す。ここでは、平均グレースケール値を使用して、異なる時点における各サンプルの蛍光強度を評価しました。

Representative Results

植物生理学におけるPD機能および病原体との相互作用の研究を促進するために、PD局在化のための3つのシンプルで信頼性の高い参照タンパク質が開発されました。2つの細胞PDタンパク質と、植物トバモウイルスTVCVによってコードされる病原体由来のMPタンパク質が選択されました。これらのタンパク質の細胞内局在は、各タンパク質のC末端に融合した自己蛍光レポー…

Discussion

正常な植物の発生と形態形成、および植物と病原体の相互作用における植物の細胞間コミュニケーションと細胞間輸送に関する細胞生物学的研究では、内因性および病原体にコードされたタンパク質と植物の細胞間接続であるプラスモデスマタ(PD)への選別の検出とモニタリングが必要です。これらの実験は、内因性か病原体由来かにかかわらず、PDに忠実かつ一貫し…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VC研究室での研究は、NIH(R35GM144059)、NSF(MCB 1913165およびIOS 1758046)、およびBARD(IS-5276-20)からのVCへの助成金によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、または出版の決定に関与していませんでした。

Materials

ABT AC 1 phase motor BRANDTECH  ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control  CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Invitrogen #11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen #11791020
GraphPad Prism 8.0.1. GraphPad Software Inc.
Image J National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope Zeiss LSM 900
Nicotiana benthamiana Plant species
pDONR207 Invitrogen #12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB #M0491S

参考文献

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記事を引用
Kan, Y., Simons, E., Citovsky, V. Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (213), e67378, doi:10.3791/67378 (2024).

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