このプロトコルは、ウイルス-プラスモデスマタ相互作用またはプラスモデマーム輸送中にプラスモデスマタを標的とするタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のための最適なプラスモデスママーカーの選択を説明しています。
Plasmodesmataは、隣接する植物細胞の細胞質をつなぎ、栄養素、高分子、侵入ウイルスの細胞間輸送を可能にする膜状のナノポアです。Plasmodesmataは、細胞間コミュニケーションの調節において基本的な役割を果たし、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用に貢献します。植物やウイルスのタンパク質の体質形成部局在を発見することは、タンパク質に関する有用な機能情報を提供する可能性があり、植物とウイルスの相互作用のメカニズムを理解するために重要です。これらの研究を容易にするために、ウイルス-プラスモデスマタの相互作用またはプラスモデスマの輸送を研究するための最適なプラスモードマーカーを選択するために、さまざまなプラスモードターゲティングタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のプロトコルについて説明します。具体的には、これらの事象の解析は、 カブ静脈透明化ウイルス (TVCV)、 シロイヌナズナPlasmodesmata-Localized Protein 5(PDLP5)、およびPlasmodesmata Callose-Binding Protein 1(PDCB1)の細胞間移動タンパク質(MP)を用いて示されています。タンパク質の体質形成局在データは、サンプリングされた組織のアニリンブルー染色を使用して、体質形成体の全体的な可視化と並行して分析されます。これらのアプローチは、プランタ内の任意の細胞タンパク質または病原体タンパク質の体質形成局在を分析するために容易に適応できます。
Plasmodesmata(PD)は、細胞間コミュニケーションの制御を通じて、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用を制御する上で基本的な役割を果たします1,2。PDは、細胞質分裂中に最初に形成され、2つの娘細胞の間の新しい細胞に数百のPDが挿入され、細胞間コミュニケーションのためのチャネルが供給されます3,4。PDは膜に富む構造であり、原形質膜3,4によって裏打ちされた細孔の中央部分に小胞体(ER)由来の膜であるtrans-PDデスモチューブルが含まれています。比較プロテオミクスアプローチにより、β-1,3-グルカナーゼ(BG)、カロース合成酵素(CALS)、原形質形成タンパク質(PDLP)、カロース結合タンパク質(PDCB)、複数のC2ドメイン膜貫通領域タンパク質(MCTP)3、ロイシンリッチリピート受容体様キナーゼ(RLK)5など、多数のPD機能タンパク質が同定されました。最近、Kirkらはplasmodesmata in silico proteome 1(PIP1)と呼ばれるツールを開発し、22の植物種6における新しいPDタンパク質を予測することを可能にしました。PDは、植物の発生中およびさまざまな応力に対する応答中に、透過性と構造が異なります。PDを取り巻く頸部領域でのカロース(β-1,3-グルカン)の沈着と加水分解は、PD調節の広く知られているメカニズムの1つです7。
真菌、細菌、ウイルスを含む多くの病原性微生物は、感染中にPDの拡張または構造を操作することができる2,8,9。イネいもち病の原因物質であるMagnaporthe oryzaeは、細胞内侵襲菌糸を配備してPD8を介して細胞から細胞へと移動します。細菌性病原体Pseudomonas syringae pv.トマトは、PDLP7との相互作用と不安定化を通じて宿主植物内での細胞間移動と拡散のためにエフェクタータンパク質HopO1-1を必要とし、シロイヌナズナ9の隣接細胞の分子フラックスを増加させます。しかし、植物ウイルスは、細胞間伝播中のPDの調節においてより汎用性が高く、ウイルス移動タンパク質(MP)は細胞間移動を促進します2。PDは、植物の発育と成長を調節する重要な機能、および植物病原性微生物との相互作用により、近年ますます注目を集めています。シロイヌナズナには、PDLP(1-8)とPDCB(1-5)の2つの主要なタイプのPD機能タンパク質があり、PDLP5 1,10,11、PDLP112、PDLP6 13、PDLP714、PDCB115など、多くのPD機能性タンパク質がカロース沈着の制御を通じてPD透過性を操作する役割を果たしていることがわかった。しかし、一部のPDLPは機能的な冗長性を有することがわかった、例えば、pdlp1およびpdlp1,2のノックアウト変異体は分子輸送に影響を及ぼさなかったが、pdlp1,3およびpdlp2,3のダブルノックアウト変異体は杉形質透過性の増加を示した16。興味深いことに、PDLP5単独のダウンレギュレーション/ノックアウトまたは過剰発現は、それぞれ漿質透過性の増加または減少をもたらします1,17。最近、Liらは、PDLP5とPDLP6が異なる細胞界面で機能することを発見した13。これらの結果は、PDLP5 が他の PDLP と非冗長な機能を持つ可能性があることを示しています。
細胞間コミュニケーションにおけるPDの重要な機能のために、私たちは植物PDタンパク質PDLP5およびPDCB1、および カブ静脈クリアウイルス (TVCV)のウイルス細胞間移動タンパク質(MP)を細胞生物学実験のためのシンプルで便利で信頼性の高いPDマーカーとして展開するためのプロトコルを開発しました。さらなる検証のために、サンプリングした組織のアニリンブルー染色を用いたPDの可視化を並行して進めました。PDLP5、PDCB1、およびTVCV MPのPD局在について記載されているプロトコルは、生きた植物における任意の細胞または病原体由来タンパク質の潜在的なPD局在を分析するために容易に適合させることができます。
正常な植物の発生と形態形成、および植物と病原体の相互作用における植物の細胞間コミュニケーションと細胞間輸送に関する細胞生物学的研究では、内因性および病原体にコードされたタンパク質と植物の細胞間接続であるプラスモデスマタ(PD)への選別の検出とモニタリングが必要です。これらの実験は、内因性か病原体由来かにかかわらず、PDに忠実かつ一貫し…
The authors have nothing to disclose.
VC研究室での研究は、NIH(R35GM144059)、NSF(MCB 1913165およびIOS 1758046)、およびBARD(IS-5276-20)からのVCへの助成金によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、または出版の決定に関与していませんでした。
ABT AC 1 phase motor | BRANDTECH | ABF63/4C-7RQ | |
Agrobacterium tumefaciens EHA105 | |||
Contamination control | CCI | ||
Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11789020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11791020 | |
GraphPad Prism 8.0.1. | GraphPad Software Inc. | ||
Image J | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 900 | |
Nicotiana benthamiana | Plant species | ||
pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | #M0491S |