概要

臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

Published: January 10, 2025
doi:

概要

ブタ角膜 ex vivo 臓器培養および上皮創傷治癒は、化学物質の眼毒性をテストするための経済的、倫理的、再現性のある、および定量的な手段を提供します。また、上皮化や組織修復の制御機構の解明や、糖尿病性角膜症や創傷治癒遅延の治療薬の評価にも役立っています。

Abstract

ブタの眼は、解剖学的および生理学的に人間の眼と類似しているため、生物医学研究や眼毒性評価のための堅牢なモデルとして機能します。ブタの眼を用いた空気/液体角膜培養システムを開発し、これらの研究の重要なパラメータとして ex vivo 上皮創傷治癒を利用しました。新鮮なブタの角膜は、上皮創傷の有無にかかわらず、臓器培養のために処理されました。角膜は、MEMの37°Cで加湿された5%CO2 インキュベーターで、試験剤の有無にかかわらず培養しました。角膜透過性と創傷治癒率を測定し、上皮細胞および/または角膜全体を免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、および分子および細胞分析のためのqPCRのために処理することができます。この研究では、詳細なプロトコルについて説明し、この ex vivo システムを使用した2つの研究を紹介します。このデータは、ブタの角膜臓器培養と上皮創傷治癒の組み合わせが、化学毒性試験、糖尿病性角膜症の研究、および潜在的な治療法の特定に適したex vivoモデルであることを示しています。

Introduction

細胞モデルはクローン集団が限られており、生物の生体内構造を再現できませんが、臓器培養または外植片は、臓器の機能、発生、疾患メカニズム、および潜在的な治療法に関する洞察を提供し、他の実験モデルよりも倫理的および生理学的利点を提供します1,2.培養外植片は、必要な動物の数を減らすだけでなく、周囲の条件を制御し、感覚的に操作するため、臓器培養環境における細胞増殖、遊走、創傷応答、および細胞分化を制御する因子の詳細な探索に理想的です2,3。さまざまな組織/器官の中で、ヒト4,5,6を含む角膜外植片は、眼毒性、刺激評価7,8、幹細胞機能9および創傷治癒10,11の根底にある分子メカニズムの研究、および原発性開放隅角緑内障12に広く使用されてきました。

ブタ角膜は、ヒトの角膜といくつかの構造的および生理学的類似性を共有しており、ヒトの角膜の生物学と疾患を研究するための優れたモデルとなっています。構造的には、どちらもボーマン層、5〜7層の上皮細胞、および同様の曲率と直径を持っています。生理学的には、それらは非常に透明であり、同様の涙液膜組成と角膜の水分補給を持ち、角膜神経支配の同等のパターンと機能を示し、同様の創傷治癒過程をたどるため、ヒトの角膜生物学と疾患を研究するための優れたモデルとなっています13,14。ヒトとブタの角膜は、コラーゲン線維の配置と水分含有量にわずかな違いがありますが、それらの免疫シグナル伝達と応答は同一ではありません。これらの違いは、異種移植15に課題をもたらします。したがって、実験データを解釈する際には、種固有の違いを考慮する必要があります。

ヒトの角膜と比較して、ブタの目は食肉産業の副産物として容易に入手できるため、費用対効果が高く、研究に容易にアクセスすることができます14。ブタの角膜を使用すると、ヒトのドナー用角膜の必要性を減らし、動物実験に関連する倫理的懸念を最小限に抑えることができます。さらに、一度に多くのブタ角膜を利用できるため、一貫性のある再現性のある実験が可能になり、信頼性の高い研究成果を得るために重要です。

ブタの角膜器官培養システムは、当初、化粧品や眼薬の動物試験を置き換えるために使用されました7。このシステムは、角膜上皮創傷治癒の研究、およびHB-EGFエクトドメイン脱落、脂質メディエーターリゾホスファチジン酸刺激、および角膜創傷治癒のためのEGFR活性化などのいくつかの重要なシグナル経路を特定するために使用されています16,17。病理学的因子として高グルコースを使用して、高血糖のex vivoモデルが確立され、上皮創傷治癒が遅延してヒト糖尿病性角膜症を模倣しました。このモデルを用いて、IL-1β対IL-1Ra18およびTGFβ3対TGFβ119のバランス発現が角膜の適切な創傷治癒のための重要な因子であることが示され、これらのバランスの操作は糖尿病性角膜症の治療に利用できる可能性がある。したがって、ブタ臓器培養は、化学毒性試験、生物医学研究、創薬、および化学兵器への眼の曝露に対する組織の損傷と修復の評価にさまざまな用途を持つ、関連性があり、経済的で、操作可能な実験システムを表しています。

この記事では、ブタ角膜器官培養の詳細なプロトコルについて説明し、眼のNSAID(NS)点眼薬が角膜の健康に及ぼす潜在的な影響を評価し、糖尿病性角膜症の病因に関与するシグナル伝達経路と生物学的プロセスを決定するためのその応用について説明します。

Protocol

新鮮な豚の角膜は食品産業の副産物であるため、施設動物管理および使用委員会は、研究のためのそれらの使用を承認する必要はありませんでした。研究に用いられているヒトの角膜とは異なり、バイオハザードの心配はなく、ブタの目の未使用部分は一般ゴミとして処分することができます。この研究に使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。 1. 臓器培養の準備 使用前に、ペニシリン-ストレプトマイシンをサプリメントとして最小必須培地(MEM)に加えてください。. 5 mMグルコース(90 mg / dLに相当)を含む1 LのサプリメントMEMに3.6 gのD-グルコースを添加して高グルコース培地を調製し、糖尿病患者の高血糖を模倣して25 mM(450 mg / dLに等しい)の最終グルコース濃度に到達します。 5 mMまたは25 mMグルコースを添加したMEMに0.2 gのアガロースを加え、アガロースが溶解するまで電子レンジで加熱することにより、5 mMまたは25 mMグルコースを添加したMEMで1%アガロースを調製します。 アガロース含有溶液を48°Cに維持された水浴に移します。 実験の前に、蒸留水、PBS、手術器具(止血剤、鉗子、メスハンドル、はさみ、トレフィン)などのすべての実験試薬、ビーカー、ペーパータオル、糸くずの出ないワイプ、手袋、ピペットチップをオートクレーブします。シリコンモールド、カミソリの刃、ブレードホルダーを70%アルコールに30分間浸し、滅菌PBSで3回洗浄します。 2. 角膜培養のためのブタ眼球調製 地元の食肉処理場から豚の眼球を入手し、湿ったチャンバー内の氷の上で実験室に輸送します。注:ウシの目も同様の方法で使用できます。ただし、ウシの目と角膜は、人間の目/角膜とはより著しく異なります。例えば、ヒトおよびブタの角膜は5〜7層の上皮細胞を有するが、一方、ウシの角膜は約20層を有する13,14。さらに、ウシの目は角膜器官の培養中に汚染される可能性が高くなります。したがって、統計分析にはより多くのウシの目が必要です。 滅菌したPBSが入った1Lビーカーに豚の目を入れます。注:ブタの眼球は屠殺後1時間以内に収集され、約2時間でラボに運ばれます。全体として、眼球は 4 時間以内に使用されました (ステップ 2.3)。 ピンセットで眼球を持ち、滅菌ペトリプレートのハサミで眼外組織を取り除きます。 眼球を蒸留水で1回、PBSで2回すすぎます。 眼球をポビドン-ヨウ素消毒液で10秒間すすぎ、続いて滅菌PBSを3回洗浄します。 眼球を20 μg/mLのゲンタマイシンを含むPBSで30分間インキュベートし、PBSで2回すすぎます。 3. 上皮の傷 滅菌した糸くずの出ないワイプで眼球を持ち、角膜の中心に6mmのトレフィンで印を付けます。 トレフィンマークの円の内側の上皮細胞を小さなメスまたは角が鈍い柔らかいかみそりの刃で優しくこすり落とし、すべての細胞の破片を取り除きますが、基底膜はそのままにし、綿棒で創傷領域を清掃します。注:上皮細胞を採取したメスは、氷の上に置いた微量遠心チューブに移すことができます。細胞は、すぐに溶解するか、-20°Cの冷凍庫に保存してコントロールとして使用することができます。 4. 角膜臓器培養と ex vivo 高血糖モデリング メスとハサミで角膜硬化膜の縁に沿って切開して眼球を解剖し、PBS(pH 7.4)を含む滅菌済みの1000mLビーカーで角膜をすすぎます。 切除した角膜を逆さまにして、無毒の液体型を作るシリコーンから作られた滅菌型に入れます。注:30 mLの超遠心チューブの底を使用して、無毒のシリコーン型成製液を50 mL組織培養/試験管ラックの穴に注ぎ、半円形の型を作ります。 48°Cに維持された1%アガロースを含むMEMで内皮角膜腔を満たし、混合物を室温でゲル化させます。 角膜を反転させて35mmの皿に移し、試験剤の有無にかかわらず2 mLのMEMを角膜中央部の表面に滴下して辺縁結膜領域を覆い、上皮を空気にさらしたままにします(図1)。 培養皿を加湿した5% CO2 インキュベーター(37°C)に置き、培地を新しいMEM培地と交換し、試験剤の有無にかかわらず、毎日2日間放置します。 MEMにL-グルコースを添加して合計25 mMのグルコースを得ることにより、 ex vivo 高血糖モデルを確立し、1%アガロースゲルの調製および培地として使用されます。 5. 角膜機能評価 損傷した角膜をリチャードソン染色20で染色して残りの創傷領域をマークし、それを撮影することにより、上皮創傷治癒率を決定します(図2および図3)。Image-JまたはPhotoshopソフトウェア(ヒストグラム)で創傷サイズを定量化します。 組織学、組織化学、および免疫組織化学分析(図2 および 図3)のために角膜をOCTおよびクライオスタット切片に埋め込むことにより、角膜を加工します。切片を氷冷アセトンで固定するか、H&E染色で染色するか、1% BSAで1時間ブロックしてTUNEL染色または免疫組織化学を行い、タンパク質やシグナル伝達分子(リン酸化ErkやATKなど)を検出します。注:ほとんどの市販の抗体は、ブタ抗原について試験されていません。しかし、抗体がヒトとマウスの両方の抗原を認識する場合、ほとんどの場合、対応するブタ抗原ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学の検出に使用できます。 染色した角膜をPBSで洗い、同じサイズのトレフィンを使用して元の傷に印を付け、マーカーサークル内の上皮細胞をスクラップします。小さなメスで上皮細胞を採取し、採取した細胞にメスを氷上で予冷した遠心チューブに浸します。 収集した細胞を-80°Cのディープフリーザーに保存するか、すぐに抽出し、ウェスタンブロッティングおよび/またはELISAの溶解を行うか、PCRのRNA抽出バッファー(必要な場合)で行います10,16,21。

Representative Results

白内障手術は、世界で最も頻繁に行われる手術の1つであり、点眼薬は術後のケアにおいて重要な役割を果たします。白内障手術後に点眼薬を塗ると、目の感染症、炎症、黄斑浮腫などの合併症を防ぐのに役立ちます。ケトロラック、ブロムフェナク、ネパフェナクなどのNSAID(NS)点眼薬は、白内障手術前、手術中、手術後の眼の痛みや腫れの治療に一般的に使用され?…

Discussion

培養されたウシおよび主にブタの角膜は、化粧品化学物質、緑内障治療薬、および非ステロイド性抗炎症薬21,26の毒性を評価するために使用されてきた。ブタの角膜は、ヒト糖尿病性角膜症のex vivoモデルとしても使用されています。ウサギの目とは異なり、ブタの目は解剖学的、生理学的、および生体力学的?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

図1のアートワークには、ウシとブタの角膜器官培養の発展に貢献してくださった許克平博士(医学博士および医学博士)とジア・イン博士(医学博士および博士)、図1のアートワークを贈呈してくださったトロイ高校のレイ・グオ博士とアンディ・ウー博士に感謝します。Yu博士の研究室での研究は、NIHの助成金(R01 EY010869、R01EY035785、P30 EY04068)とKresge Eye Instituteの失明予防研究から資金提供を受けました。

Materials

1.7 mL tubes Axygen AXYMCT175SP
Agarose  Thermo Scientific R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09% 
Camera Canon PowerShot A620
Cell Culture Dish Corning 430165
D-glucose  Sigma 50-99-7
Dissecting microscope  Zeiss Stemi 2000c
Forceps FisherScientific 10-316A
Hemostat FisherScientific 13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45% Kresge Clinic
Kimwipes Kimtech 34155
LL-37 Tocris 5213/1
Minimum essential medium (MEM)  Gibco A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1% 
Penicillin-streptomycin  Gibco 15070063
Phosphate buffered saline Sigma P4417
Pig eyes  Bernthal Packing Inc.
Pipet tips VWR 76322-164
Porcine corneas Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI 
Povidone-Iodine  Betadine
Q-Tips cotton swabs Q-Tips
Razor blade Electron Microscopy Sciences 72002-01
Razor blade holder  Stotz
Scalpel Bard-Parker 377112
Scalpel Handle Bard-Parker #3
Scissors FisherScientific 08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure Labconco 5100000
Trephine Acu.Punch 3813775
Water bath  VWR 1235

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記事を引用
Gao, N., McDermott, M., Yu, F. Evaluating Therapeutic and Chemical Toxicity Using Organ-Cultured Porcine Corneas and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (215), e67326, doi:10.3791/67326 (2025).

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