腸内グリアは、腸の恒常性や術後合併症を含む疾患プロセスにおける役割についてますます認識されるようになっています。緊急の探索的開腹術から回復した馬の患者は、炎症性術後疾患のリスクが高いことに苦しんでおり、研究のために再現性のある馬の腸内グリア初代細胞培養を確立することの重要性が強調されています。
ウマ疝痛(急性腹部)の炎症性術後状態は、クライアントの費用、患者の不快感、入院時間の増加に寄与するだけでなく、多くの場合、生命を脅かすことが証明されています。腸内細胞のユニークな集団である腸内グリアは、胃腸環境を感知し、周囲の細胞タイプとコミュニケーションをとる役割についてますます認識されています。腸内グリアと腸上皮との間の相互作用は、馬の腸内グリアが粘膜バリアを変化させて健康と疝痛の炎症を調節する方法を確立する上で重要であることが証明される可能性があります。
この相互作用を研究するために、ウマ空腸から一次ウマ腸グリア培養を確立し、培養物を疝痛に存在することが知られている炎症状態にさらす方法を提示します。一次腸管グリア培養物は、疝痛とは無関係の理由で安楽死させた成馬から得られた。腸絨毛と固有層をマイクロ解剖して粘膜下層を露出させました。単離された粘膜下組織体は、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、およびウシ血清アルブミンによる酵素消化を2〜3時間受けました。次に、遠心分離、ピペッティング、および細胞ストレーナー(40-100 μm)を含む機械的消化により、0.05 mg/mLのポリ-L-リジンコーティングウェルに~400,000細胞/300 μLの培地の濃度でプレーティングするために使用されるペレットが得られました。
コンフルエンスと最初の継代に続いて、腸管グリア細胞をウマ組換えIL-1β(0、10、25 ng)に24時間曝露しました。疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するために、コントロールまたは治療された腸グリアのいずれかによって調整された培地を、二重電極EndOhmチャンバーを使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定しながら、コンフルエントなウマ空腸単層に直接追加しました。これらのデータは、ウマの腸管グリア培養の多くの潜在的影響力のある応用の1つに過ぎません。
馬の疝痛は、緊急相談のための最も一般的な医学的提示の苦情です1。これらの馬の最大17%が外科的矯正を必要としているため、術後の転帰を増やすための努力は、馬の医学研究の最前線にあるべきです2。現在、術後疝痛患者は、敗血症/内毒素ショック(患者の12.3%)や術後イレウス(患者の13.7%)3など、生命を脅かすいくつかの障害のリスクが高くなっています。術後合併症の治療は進んでいるものの、これらの疾患の予防や治療には高度な治療法が引き続き求められています。
最近の研究では、疝痛患者の局所的および全身的な炎症状態が強調されています4.例えば、腫瘍壊死因子(TNF)α、インターロイキン1β(IL-1β)、インターロイキン6(IL-6)、単球化学誘引性タンパク質-1などの炎症誘発性タンパク質は、いずれも正常な腸組織と比較して、疝痛腸粘膜における発現が有意に増加することが示されている4。全身の観点から、腸組織における TNF アルファの増加は、術後経鼻胃逆流のリスク増加と相関していることが実証されています 2 L を超える、術後の運動障害の一般的な測定値 4.また、インターロイキンIL-1βおよびTNFαの投与は、敗血症性ショック5の臨床徴候を誘発することができることも知られている。
疝痛腸組織の炎症状態とその術後合併症との関連についての潜在的な説明は、腸上皮バリアです。健康では、腸管を覆う円柱上皮の単層をつなぐタイトジャンクション複合体は、管腔内容物とその細菌成分が粘膜下腔と血流に到達するのを制限する機能的な障壁を提供します。しかし、手術中の疝痛に伴う腸閉塞や腸管操作による膨満感や損傷により、この腸バリア機能が乱れる可能性があります。
腸壁全体の機能的構成要素に関しては、腸神経系内の粘膜下腸管グリアネットワークは、炎症経路に関連する術後合併症の病態生理学的進行に重要であることが示されており、特定の治療標的を提供する可能性があります6,7,8,9 .腸内グリアは、胃腸管全体に存在するだけでなく、腸内環境のセンサーとして働き、腸壁の多数の細胞タイプでシグナル伝達に影響を与え、腸バリア6を直接調節します。したがって、これらの腸の強力なセンサーは、損傷や炎症によって活性化され、バリア透過性の変化などの急性反応を引き起こす可能性があると推定するのが妥当です。
この研究は、ウマの腸内グリアの培養、より具体的には、炎症性ウマ腸グリアが腸のバリア機能に果たす役割について説明した最初の研究です。ここでは、ウマの粘膜下腸グリアの初代培養法と炎症性IL-1βへの曝露に対する反応、IL-1β曝露後の腸グリア生成物がウマ腸細胞単層の透過性に及ぼす影響の評価、およびウマ血清の適用による遮断の可能性について紹介します。
この研究の目的は、ウマの粘膜下腸グリアの初代培養の再現性のある方法を開発し、疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するためのその応用を実証することでした。腸内グリアの分離と培養は、ウマでは新規であり、ブタとげっ歯類のモデル、およびヒトの腸疾患経路を理解するのに有益であることが証明されています6,7,13,14。<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
著者は、このプロジェクトに資金を提供してくれたモリス動物財団に感謝します。
1 M HEPES buffer | Gibco | 15630-080 | |
10 mM HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
2 mM GlutaMAX | Life Technologies | 25050-061 | |
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol | Invitrogen | D3571 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
Alpha smooth muscle actin antibody | Abcam | 7817 | |
Amphotericin B | Sigma | AA9529 | 4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL |
Anti-Antimicotic 1x | Gibco | 15240-096 | |
B27 | Gibco | 12587010 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | AA3311 | |
BSA 50 mg/mL stock solution | Sigma | A3311 | |
CaCL2 | ACROS Organiics | 206791000 | Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
Collagenase | Sigma | 9891 | |
DMEM-F12 media | Thermo Fisher | 11320033 | |
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Invitrogen | 21207 | |
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber | World Precision Instruments | EVM-EL-03-01 | |
EVOM Manual for TEER Measurement | World Precision Instruments | EVM-MT-03-01 | |
G5 | Gibco | 17503012 | |
Gentamicin solution | Sigma | G1272 | Final concentration 20 µg/mL |
GFAP antibody | Abcam | 4674 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 28175 | |
IL-1β ELISA | Thermo Fisher | ESIL1B | |
KCl | Thermo Fisher | P330-500 | Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
L-glutamine solution | Corning | 25-00-Cl | |
Matrigel | BD Bioscience | 354277 | |
MgCl2 | Thermo Fisher | M33-500 | Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
N2 | Gibco | 17502048 | |
Na2HPO4 | Thermo Fisher | BP332-1 | Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”. |
NaCl | Thermo Fisher | S271-10 | Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
NaH2PO4 | Thermo Fisher | BP329-500 | Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”. |
NaHCO3 | Thermo Fisher | S637-212 | Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”. |
Pen/Strep solution | Gemini | 400-109 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | 0.5 mg/mL in 1x borate buffer |
Prism software | GraphPad | ||
Protease | Sigma | P4630 | |
Sodium bicarbonate solution | Sigma | S8761 | 7.5% stock solution |
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