概要

馬の腸管グリア培養と馬疝痛の神経炎症メカニズムの研究への応用

Published: October 04, 2024
doi:

概要

腸内グリアは、腸の恒常性や術後合併症を含む疾患プロセスにおける役割についてますます認識されるようになっています。緊急の探索的開腹術から回復した馬の患者は、炎症性術後疾患のリスクが高いことに苦しんでおり、研究のために再現性のある馬の腸内グリア初代細胞培養を確立することの重要性が強調されています。

Abstract

ウマ疝痛(急性腹部)の炎症性術後状態は、クライアントの費用、患者の不快感、入院時間の増加に寄与するだけでなく、多くの場合、生命を脅かすことが証明されています。腸内細胞のユニークな集団である腸内グリアは、胃腸環境を感知し、周囲の細胞タイプとコミュニケーションをとる役割についてますます認識されています。腸内グリアと腸上皮との間の相互作用は、馬の腸内グリアが粘膜バリアを変化させて健康と疝痛の炎症を調節する方法を確立する上で重要であることが証明される可能性があります。

この相互作用を研究するために、ウマ空腸から一次ウマ腸グリア培養を確立し、培養物を疝痛に存在することが知られている炎症状態にさらす方法を提示します。一次腸管グリア培養物は、疝痛とは無関係の理由で安楽死させた成馬から得られた。腸絨毛と固有層をマイクロ解剖して粘膜下層を露出させました。単離された粘膜下組織体は、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、およびウシ血清アルブミンによる酵素消化を2〜3時間受けました。次に、遠心分離、ピペッティング、および細胞ストレーナー(40-100 μm)を含む機械的消化により、0.05 mg/mLのポリ-L-リジンコーティングウェルに~400,000細胞/300 μLの培地の濃度でプレーティングするために使用されるペレットが得られました。

コンフルエンスと最初の継代に続いて、腸管グリア細胞をウマ組換えIL-1β(0、10、25 ng)に24時間曝露しました。疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するために、コントロールまたは治療された腸グリアのいずれかによって調整された培地を、二重電極EndOhmチャンバーを使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定しながら、コンフルエントなウマ空腸単層に直接追加しました。これらのデータは、ウマの腸管グリア培養の多くの潜在的影響力のある応用の1つに過ぎません。

Introduction

馬の疝痛は、緊急相談のための最も一般的な医学的提示の苦情です1。これらの馬の最大17%が外科的矯正を必要としているため、術後の転帰を増やすための努力は、馬の医学研究の最前線にあるべきです2。現在、術後疝痛患者は、敗血症/内毒素ショック(患者の12.3%)や術後イレウス(患者の13.7%)3など、生命を脅かすいくつかの障害のリスクが高くなっています。術後合併症の治療は進んでいるものの、これらの疾患の予防や治療には高度な治療法が引き続き求められています。

最近の研究では、疝痛患者の局所的および全身的な炎症状態が強調されています4.例えば、腫瘍壊死因子(TNF)α、インターロイキン1β(IL-1β)、インターロイキン6(IL-6)、単球化学誘引性タンパク質-1などの炎症誘発性タンパク質は、いずれも正常な腸組織と比較して、疝痛腸粘膜における発現が有意に増加することが示されている4。全身の観点から、腸組織における TNF アルファの増加は、術後経鼻胃逆流のリスク増加と相関していることが実証されています 2 L を超える、術後の運動障害の一般的な測定値 4.また、インターロイキンIL-1βおよびTNFαの投与は、敗血症性ショック5の臨床徴候を誘発することができることも知られている。

疝痛腸組織の炎症状態とその術後合併症との関連についての潜在的な説明は、腸上皮バリアです。健康では、腸管を覆う円柱上皮の単層をつなぐタイトジャンクション複合体は、管腔内容物とその細菌成分が粘膜下腔と血流に到達するのを制限する機能的な障壁を提供します。しかし、手術中の疝痛に伴う腸閉塞や腸管操作による膨満感や損傷により、この腸バリア機能が乱れる可能性があります。

腸壁全体の機能的構成要素に関しては、腸神経系内の粘膜下腸管グリアネットワークは、炎症経路に関連する術後合併症の病態生理学的進行に重要であることが示されており、特定の治療標的を提供する可能性があります6,7,8,9 .腸内グリアは、胃腸管全体に存在するだけでなく、腸内環境のセンサーとして働き、腸壁の多数の細胞タイプでシグナル伝達に影響を与え、腸バリア6を直接調節します。したがって、これらの腸の強力なセンサーは、損傷や炎症によって活性化され、バリア透過性の変化などの急性反応を引き起こす可能性があると推定するのが妥当です。

この研究は、ウマの腸内グリアの培養、より具体的には、炎症性ウマ腸グリアが腸のバリア機能に果たす役割について説明した最初の研究です。ここでは、ウマの粘膜下腸グリアの初代培養法と炎症性IL-1βへの曝露に対する反応、IL-1β曝露後の腸グリア生成物がウマ腸細胞単層の透過性に及ぼす影響の評価、およびウマ血清の適用による遮断の可能性について紹介します。

Protocol

馬の腸管グリア初代培養物は、この研究とは無関係の理由でバルビツール酸の過剰摂取で人道的に安楽死させた3頭の馬から得られました。培養研究のために選択された馬は、胃腸疾患の現在の病歴がない成馬でした。 1.粘膜下、ウマ、腸内グリア、一次培養 3頭の別々の成馬馬から得られた空腸陰窩から馬の上皮単層を成長させます。24ウェルプレートをコーティング溶液で37°Cで2時間または室温で一晩コーティングし、滅菌水で2回洗浄し、細胞がプレーティングの準備ができるまで室温で保存します。 人道的な安楽死に続いて、60分以内に空腸の一部を取り出し、氷の上の冷たいリンガー溶液に入れます。 空腸から10cmの部分を取り出し、非リンパ領域を組織の中心に保つために、無腸境界で開きます。部分を約7cmx7cmのセクションにトリミングします。解剖する前に、新しいリンガー溶液で組織をよくすすいでください。 シリコンエラストマーでコーティングされたペトリ皿に組織を冷たいリンガー溶液またはPBS粘膜面を上にして固定し、組織をできるだけ伸ばします(図1A)。 湾曲した鉗子(図1B)で腸絨毛を切除し、続いて約5 cm x 5 cmの非リンパ領域(図1C)から固有層層を切除します。注:これらの層は粘膜下組織から容易に分離します(図1B)。 粘膜下組織を片方の角にあるマイクロダイセクションハサミで解放して1枚のシートから取り出し、空腸の内側の円形筋層から粘膜下組織を剥がしながら自然な分離を観察します(図1D)。 採取した粘膜下層を2〜5mmに細かく刻み、5mLの「Organo-FBS」(表1)、0.825mgのコラゲナーゼ、5mgのプロテアーゼ、および20mgのウシ血清アルブミンを含む50mLの円錐管に入れます。組織を37°Cで2〜3時間インキュベートし、酵素消化します。 インキュベーション後、室温の「オルガノ+FBS」を10mL加えて酵素の作用を停止します。10 mLの血清学的ピペットで組織混合物を約15回上下にピペットで動かし、組織から細胞を解離した後、室温で3,000 × g で3分間遠心分離します。 上清を廃棄し、10 mLの血清学的ピペットで約15回ピペッティングを再び上下させて、ペレットを10 mL室温PBSで再懸濁し、組織から細胞を解離します。 コニカルチューブを3,000 × g で室温で3分間遠心分離します。上清を捨て、10 mLの血清学的ピペットで約15回ピペッティングして、室温の「Organo + FBS」でペレットを再懸濁し、組織から細胞を解離します。 100 μm、70 μm、40 μmの細孔サイズのセルストレーナーで細胞を連続的にろ過します。 ろ過した細胞と培地を3,000 × g で室温で3分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを「オルガノ+FBS」1mLに再懸濁します。 トリパンブルーで染色して生細胞を同定し、血球計算盤でカウントします。 24ウェルプレートの各ウェルで、300 μLの「Organo + FBS」に約400,000個の細胞をシードし、各ウェルに成長因子(N2 5 μL/ウェル、G5 5 μL/ウェル、B27 10 μL/ウェル)を添加します。24ウェルプレートを5% CO2 を入れた37°Cインキュベーターに置き、細胞を接着させます。24時間後、メディアを上記の成長因子を持つ「グリアメディア」(表1)に交換し、48時間ごとに交換します(図2)。 2. 免疫蛍光細胞診 腸管グリア細胞を初代培養(P0)(ステップ2.1.14)から70〜80%のコンフルエントまで増殖させ、それらを1回継代します(P1)。 0.1% PBSアジドを塗布する前に、4%パラホルムアルデヒドを使用して1次培養(P0)細胞をウェル内で5分間固定します。 PBSアジド、4%ロバ血清、および0.5%Triton-Xからなる飽和溶液を調製します。300 μLの飽和溶液をウェルに加え、室温で2時間細胞を透過処理します。 グリアマーカーの一次抗体であるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)と線維芽細胞マーカーの一次抗体であるα平滑筋アクチンを飽和溶液で1:1,000希釈で添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。 ロバ抗ウサギIgG Alexa Fluor 594およびヤギ抗マウスIgG Alexa Flour 488の二次抗体を添加する前に、PBSで3回洗浄し、飽和溶液で1:500希釈して2〜3時間。 核を4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)でPBSで1:1,000希釈して5分間染色します。 PBSで3回洗浄した後、細胞を0.1%PBSアジドに保存します。 3. 粘膜下、ウマ腸内グリア、初代培養IL-1β曝露 最初の継代(P1)の細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、IL-1β曝露実験を行う。ウェルを0 ng、10 ng、および25 ngのIL-1βに24時間さらします。24時間後、各ウェルからの培地を-80°Cで保管し、保存します。 4. 腸細胞単分子膜の作製のためのウマオルガノイド培養 注:2018年に発表されたStewartらのプロトコルに従って、バンク化された馬の腸の陰窩と凍結バンクされた芽は、2Dエンテロイド研究10のために拡張されました。 トランズウェルインサートあたり約700〜1,000個の芽/陰窩フラグメント(単一細胞に解離した場合は40,000〜50,000個の細胞)を使用します。腸細胞を添加する前に、トランズウェルインサートに42μLの0.05%マトリゲルをコーティングします。マトリゲルをインサートに固定するには、37 °Cで1時間インキュベートします。余分な培地を吸引し、トランズウェルを蓋なしで30分間乾燥させます。各トランズウェルインサートに200 μLのDMEM-F12培地を加え、プレートを37°Cで保存して使用します。 オルガノイドを含むマトリゲルパテをPBSで洗浄し、氷上で500μLの細胞回収にさらします。それらを繰り返しピペットで動かして、細胞が15 mLチューブに完全に収集されるようにします。 チューブを300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去し、腸管上皮幹細胞(IESC)培地の目標容量に細胞ペレットを懸濁します。目的の単分子膜の数に200μLの培地を掛けて、目標体積を計算します。(表1)。 1 mLシリンジをIESC培地にプレコートし、16 Gの針で細胞懸濁液を吸引します。16 Gの針を28 Gの針に交換し、細胞懸濁液を排出してオルガノイドの分離を促進します。 得られた細胞懸濁液の200μLを被覆したトランズウェルの頂端側に、500μLのIESCおよび前述の成長因子をトランズウェルインサート10の基底側に置く。コンフルエンスに達するまで、24〜48時間ごとに培地と成長因子を交換します。コンフルエンスは、1,000 Ωsxcm 2,11 の TEER に対応するセル密度として定義します。測定については、ステップ5.1を参照してください。 5. 炎症性サイトカインおよびウマ腸グリア産物への曝露後のウマ腸細胞単層透過性 二重電極TEER測定チャンバーを使用して、単層全体のTEERを定量化し、各トランズウェル透過膜全体のベース読み取り値を確立します。測定を行う前に、IESC媒体とトランズウェルが室温になるまで15分かかることを確認してください。カルチャーカップに1.5 mLのIESC培地を満たし、トランズウェルインサート内に正確に200 μLの培地が存在することを確認して、測定時に流体ラインが一致するようにします。 トランズウェルインサートの基底外側を、ウェルあたり25 ng IL-1β、10 ng、および25 ngのインターロイキン6(IL-6)の炎症性サイトカイン、または10 ngまたは25 ngのIL-1βに曝露した培養物のグリア産物に曝露します。コントロールトランズウェルインサートの基底外側をグリア培地に、およびIL-1βに曝露されていない培養物からのグリア培地に曝露します。 各トランズウェルを培養カップに入れて、10〜15分間隔でTEERを45分間測定します。 6. 統計学 各トランズウェルのTEERの時間軸変化を、0分、10分、20分、30分、45分で計算します。 選択したソフトウェア( 資料表を参照)を使用して、減少したTEERとIL-1β(25 ng)、IL-6(10 ng、25 ng、および100 ng)、およびグリア培地(0 ng IL-1β、10 ng IL-1β、および25 ng IL-1βに曝露)への基礎側曝露との相関を比較し、不対応の片側 t検定を使用して培地を制御します。

Representative Results

ウマの空腸を粘膜下層までマイクロダイセクション(図1)すると、さらに酵素的および機械的消化が行われ、ウマの腸グリアの生存細胞培養が可能になる可能性がある。細胞は、他の種の腸管グリアと一致する紡錘形細胞の優勢を伴う多形性を示しました(図2A)。培養物は、選択的グリアマーカーであるグリア線維性酸性タ?…

Discussion

この研究の目的は、ウマの粘膜下腸グリアの初代培養の再現性のある方法を開発し、疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するためのその応用を実証することでした。腸内グリアの分離と培養は、ウマでは新規であり、ブタとげっ歯類のモデル、およびヒトの腸疾患経路を理解するのに有益であることが証明されています6,7,13,14。<sup clas…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、このプロジェクトに資金を提供してくれたモリス動物財団に感謝します。

Materials

1 M HEPES buffer Gibco 15630-080
10 mM HEPES Life Technologies 15630-106
2 mM GlutaMAX Life Technologies 25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol Invitrogen D3571
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody Abcam 7817
Amphotericin B Sigma AA9529 4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x Gibco 15240-096
B27 Gibco 12587010
Bovine Serum Albumin Sigma AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution Sigma A3311
CaCL2 ACROS Organiics 206791000 Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase Sigma 9891
DMEM-F12 media Thermo Fisher 11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen 21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber World Precision Instruments EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement World Precision Instruments EVM-MT-03-01
G5 Gibco 17503012
Gentamicin solution Sigma G1272 Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody Abcam 4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen 28175
IL-1β ELISA Thermo Fisher ESIL1B
KCl Thermo Fisher P330-500 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution Corning 25-00-Cl
Matrigel BD Bioscience 354277
MgCl2 Thermo Fisher M33-500 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2 Gibco 17502048
Na2HPO4 Thermo Fisher BP332-1 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl Thermo Fisher S271-10 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4 Thermo Fisher BP329-500 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3 Thermo Fisher S637-212 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution Gemini 400-109
Poly-L-lysine Sigma P2636 0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software GraphPad
Protease Sigma P4630
Sodium bicarbonate solution Sigma S8761 7.5% stock solution

参考文献

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記事を引用
Hellstrom, E., McKinney-Aguirre, C., Gonzalez, L., Ziegler, A., Blikslager, A. Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic. J. Vis. Exp. (212), e67244, doi:10.3791/67244 (2024).

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