概要

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

Published: September 27, 2024
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概要

提案されたプロトコルは、マルチモーダル分析を使用して骨再生の文脈で骨形成を評価するためのグローバルなアプローチを伴います。これは、新しい骨形成に関する定性的および定量的な情報を提供し、基本的および前臨床研究の厳密性と妥当性を高めることを目的としています。

Abstract

骨再生の文脈における組織石灰化の広範な特性評価は、現在分析に利用可能な多数のモダリティを考えると、大きな課題を表しています。ここでは、関連する大型動物骨ex vivo 外植片を用いて、新しい骨形成を包括的に評価するためのワークフローを提案する。骨欠損(直径= 3.75 mm、深さ= 5.0 mm)が外植された羊の大腿骨頭に作成され、骨形成促進性成長因子(骨形態形成タンパク質2-BMP2)をロードしたマクロ多孔質骨代替物が注入されます。その後、外植片を28日間培養中に保持し、細胞のコロニー形成とその後の骨形成を可能にします。新たに石灰化した組織の品質と構造を評価するために、次の連続した方法が設定されます:(i)マイクロCTを使用した外植片全体の特性評価と高解像度3D画像、続いて石灰化組織の識別を強化するための深層学習画像分析。(ii)新たに形成された組織の機械的特性を決定するためのナノインデンテーション。(iii)ヘマトキシリン/エオシン/サフラン(HES)、ゴールドナートリクローム、モバットペンタクロームなどの組織学的検査により、特に骨様バリアの視覚化と骨細胞の存在に関して、石灰化組織の定性的評価を提供します。(iv)石灰化の程度を定量化し、表面形態、鉱物組成、および骨-生体材料界面に関する詳細な洞察を提供するための内部参照を使用した後方散乱走査型電子顕微鏡(SEM)マッピング。(v)ラマン分光法により、鉱化マトリックスの分子組成を特徴付け、ペプチド結合の検出を通じてセメント内のBMP2の持続性に関する洞察を提供します。このマルチモーダル分析は、新しく形成された骨の効果的な評価と、石灰化組織に対する包括的な定性的および定量的洞察を提供します。これらのプロトコルの標準化を通じて、研究間の比較を容易にし、研究成果の妥当性と信頼性を向上させることを目指しています。

Introduction

骨の欠損は、外傷、腫瘍切除、先天性異常、感染などによって引き起こされるかどうかにかかわらず、再生医療にとって大きな課題となっています。これらの変化は、骨格系の構造的完全性を損ない、不快感、機能障害、および患者の生活の質の低下につながります。

これらの課題を克服するために、骨形成と骨組織再生の強化に焦点を当てた革新的な骨修復戦略が登場しました。これらのアプローチには、埋め込み型、注射用、または3Dプリント可能な骨代替物の使用が含まれ、これらは天然由来(バイオソースの高分子、動物由来のヒドロキシアパタイトなど)または合成(バイオグラス、リン酸カルシウムなど)1です。骨再生を誘導し刺激する骨の生来の低能力を強化するために、骨代替物に骨形成タンパク質(BMP)などの骨誘導因子を充填して、前駆細胞の骨形成分化を促進し、骨形成を促進することができます2

骨形成は、コラーゲンマトリックスの初期形成に基づいており、その後、ヒドロキシアパタイト結晶によって石灰化され、それによって骨構造3が強化されます。このプロセスにより、骨に特定の剛性と強度が与えられます。石灰化組織の品質は、その微細構造属性と石灰化の程度によって複雑に支配されます4。この品質は、骨の治癒と再生された骨5の機能において極めて重要な役割を果たします。しかし、骨の石灰化を特徴づけることは、多変量研究6,7,8における固有のばらつきのために、依然として困難な課題である。

さらに、骨移植代替物の生体適合性、細胞適合性、および分化の可能性の初期評価は、通常、 in vitroで実施されます。しかし、方法論的な格差が、アウトカムのシームレスな比較を妨げています。さらに、これらの in vitro 研究は、骨再生プロセスの調節に不可欠な骨髄細胞を含む細胞集団間の多細胞相互作用と複雑な相互作用を完全には捉えていません9。骨微小環境の正確な表現の欠如は、その後の前臨床研究10の精度を損なう可能性があります。

in vivo評価は、生理学的状況をより正確に表現しますが、倫理的、ロジスティック、および財政的な考慮事項によって制約されます。したがって、ex vivo評価は、in vitro研究とin vivo研究の間のインターフェースとして極めて重要な役割を果たし、生きた被験者11,12,13の実験に進むための必要な中間ステップとして機能します

これに関連して、再生された骨組織の品質を評価し、前臨床モデルに移行する前に戦略の関連性を確保するためには、包括的な特性評価手法の実装が必要です。そこで、ヒツジの膝関節組織を用いた外植片モデルの解析に基づくプロトコールを提案する。この革新的な方法論では、BMP2を充填したセメントを外植片に埋め込み、28日間の培養後に組織の石灰化を詳細に分析します。

この研究で採用された技術的アプローチは多様で補完的であり、再生された骨組織の品質を評価するための包括的なアプローチをまとめて提供します(図1)。高解像度のマイクロCTイメージングにより、骨構造の詳細な3D視覚化が可能になり、新しく形成された組織のミネラル密度、形態、完全性に関する貴重な洞察が得られます。この手法は、骨再生の有効性を評価し、経時的な石灰化の進行を監視するために重要です。ナノインデンテーションは、組織の硬さや強度など、組織の機械的特性を決定するための正確なアプローチです。この方法では、ナノメートルスケールで加えられた力に対する材料の応答を測定することにより、石灰化組織の堅牢性と品質を評価できます。ヘマトキシリン/エオシン/サフラン(HES)、ゴールドナートリクローム、モバットペンタクロムなどの一般的な染色法を用いた組織学的検査は、組織の構造と組成に関する貴重な洞察を提供します。これらの染色により、細胞、細胞外マトリックス、ミネラル沈着物など、さまざまな組織成分の分化が可能になり、骨再生プロセスの包括的な定性的評価が可能になります。後方散乱走査型電子顕微鏡(SEM)マッピングは、サンプルの表面を高解像度で可視化し、骨基質の石灰化の程度や、埋め込まれた材料と宿主組織との間の界面の詳細な分析を可能にします。最後に、ラマン分光法は、特にタンパク質、脂質、ミネラルなどの特定の成分の同定を通じて、組織の分子組成に関する情報を提供します。このアプローチにより、鉱化マトリックスの特性評価とBMP2などの成長因子の検出が可能になり、再生培地における骨形成促進性刺激の持続性に関する重要な情報が得られます。

私たちの研究は、さまざまな分析技術を統合した学際的なアプローチを使用して、再生された骨組織の品質の徹底的かつ包括的な評価を提供することを目指しており、したがって、骨移植代替物の評価とその潜在的な臨床応用のための強固な基盤を提供します。

Protocol

この研究は、倫理および動物福祉委員会およびフランス国立獣医食品局によって番号G44171で承認されています。 1. 骨軟骨外植片の調製と培養 無菌環境で安楽死させたばかりの動物から羊の関節標本を収穫します。羊を仰臥位に置き、左後肢を剃ります。膝関節の周りをアルコールで消毒して準備します。外側傍膝蓋骨切開術を使用して、前十字靭帯と後十字靭帯を露出させ、続いて膝蓋骨脱臼を使用して大腿骨滑車を明らかにします。組織採取後、骨軟骨自家移植システムを使用して、外側顆に直径 4.75 mm の欠損を作成します。 整形外科用ハンマーを使用して、深さ10mmの欠陥を作成し、顆から外植片を回収します。続いて、骨軟骨自家移植システムを使用して、最初の欠陥を中心に直径8mmの2番目の欠陥を行います。これにより、8 mm x 10 mmの骨軟骨外植片が得られ、4.75 mm x 10.0 mmの中央欠損が含まれます。 物流上の理由から必要な場合は、外植片を1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したハンク平衡塩溶液(hBSS)で輸送し、4°Cで保存します。 外植片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回すすぎ、4.75 mm x 10.0 mmの欠損部に40 μg/mLのBMP2を添加したリン酸カルシウムセメントを注入します。以下に説明するようにセメントを準備します。アパティックリン酸三カルシウムロッド(120 MPaの静水圧プレス)を1364°Cで最低12時間熱処理することにより、α-リン酸三カルシウム(α-TCP)を製造し、続いて14を空冷します。 α-TCPロッドを無水エタノール中で遊星ミルボール2回、500rpmで5分間粉砕し、13.1±1.7μmの微粉末を生成します(前述のように、レーザー回折を使用して測定14)。 α-TCP粉末を180°Cで45分間乾熱して滅菌します。リン酸カルシウムセメントを、α-TCP粉末を2.5%(w / v)Na2HPO4 0.22μmろ過溶液(液体/粉末比0.35)と1分間混合して調製します。 18Gの針を使用して注入する前に、セメントペーストを3mLのシリンジに入れます。 室温(RT)で10分後、外植片を25cm²のフラスコに移し、10%のウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補給したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)高グルコースからなる10mLの完全培地を穏やかに加えます。 外植片を5% CO2 の入った37°Cインキュベーターで最大28日間維持し、層流フードの下で2日ごとに全培地を交換します。 外植片をPBSで3回すすぎます。それらを50 mLチューブに移し、20 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、4°Cで3日間保持します。次に、外植片をPBSですすぎ、70%エタノールで保存してから、その後の分析を行います。 2. マイクロCT解析 マイクロCTX線を用いたマイクロトモグラフィー解析を行います。10.7 μmの分解能でX線投影を取得し、露光時間は1200 ms、1 mmのアルミニウムフィルター(80 kVおよび125 μA)を使用します。0.45°の回転増分ごとに3つの画像を平均化して、S/N比を向上させます。 リファレンススキャンによるX/Yアライメント後、メーカーの再構築ソフトウェアを使用して3次元(3D)画像を再構築します。これには、スムージング:0、リングアーティファクト:3、ビーム硬化:35%のパラメータがあります。画像処理ソフトウェアで画像スタックをクリーニングし、2次元(2D)および3D視覚化ツールで観察します。 3. ディープラーニングによる画像解析 専用の専用ソフトウェアを使用して画像セグメンテーションを行います。統合セグメンテーション ウィザードを使用して、骨とセメントの識別のための深層学習モデルに学習させます。 再構成されたマイクロCT画像から、骨、セメント、および背景を含む代表的なゾーン(フレーム)を選択します。この最初のフレームは、ソフトウェアが提供する単純なツール(しきい値など)または強力なツール(伝播など)を使用して手動でセグメント化します。 [モデル] タブでディープ ラーニング モデルを生成し、ドロップダウン メニューで [3D-Unet ルーチン ] を選択します。生成されたモデルを右クリックして分析する画像を使用して、その実験パラメータをadequationで定義します。ここで、深さ5、パッチサイズ32 x 32、Adadetla アルゴリズム、ストライド比 0.25、データ拡張 x10。 セグメント化されたフレームを使用して、深層学習ルーチンを訓練します(「Train Button」をクリック)が、これは、その高速で正確な画像セグメンテーション機能3,15に関連していると認められています。トレーニングが完了したら、2 番目の作業ゾーン (フレーム) を定義し、predict 関数を使用して自動的にセグメント化します。必要に応じて手動修正を適用して、より正確なトレーニング データを生成します。もう一度ルーチンを訓練します。満足のいく結果が得られるまで、このプロセスを繰り返します。データ拡張の数は、トレーニング フレームの数が増えるにつれて徐々に減少します。注: モデルのトレーニング中に提供される DICE インデックスは、(入力情報と比較して) モデルの精度を示しますが、十分ではありません。モデルの関連性の確認は、3人の独立した経験豊富な研究者による自動的にセグメント化されたデータの検証によって実行する必要があります。 「Export」ボタンをクリックしてモデルを公開し、「Segment > Exported Model > Segment Full Dataset」をクリックして、マイクロCTデータセット全体に適用します。 4. 埋め込み 骨外植片を、70%アセトンと30%キシレンで構成される25mLの脱水溶液を含む40mLガラスバイアルに入れて脱水します。.ガラスバイアルを回転ホイールに置き、RTで1時間、この手順を3回繰り返します。 脱水溶液を25 mLのキシレンと交換し、ガラスバイアルを回転ホイールにRTで1時間置きます。. キシレン溶液を、10%過酸化ベンゾイル(BPO)および10%フタル酸ジブチル(DBP)を含む25mLのメタクリル酸メチル(MMA)に置き換えます。.RTで1時間回転ホイールに置き、この手順を2回繰り返します。 MMA溶液を、10%BPO、10P、およびプロパン-2-オールで1:20に希釈した450μLのN、Nジメチルアニリンを豊富に含んだ25mLのMMAと交換します。ガラスバイアルを-20°Cに一晩置きます。溶液は黄色がかった色になります。 外植片を中型の埋め込み型に入れ、MMA-BPO-DBP-N、Nアニリンを型に流し込みます。金型をプラスチックの箱に入れ、窒素の流れで5分間換気します。ボックスを密閉して閉じ、MMA重合と硬化のために4°Cで48時間置きます。 外植片を含む樹脂を金型から取り出し、その後の分析のために処理されるまで4°Cに保ちます。 5. 走査型電子顕微鏡(SEM) – 定量的反射電子イメージング(qBEI) 外植片を含むpMMAブロックを、その長軸に沿ってダイヤモンドソーでカットします。ブロックの前半は組織学的解析のために保持します。残りの半分をさらにカットして、厚さ1.5mmのセクションを生成します。3000rpmで3mm/minの速度でカットします。 SiC 320 for 10 s、SiC 1000 for 15 s、SiC 2000 for 30 s、SiC 4000 for 30 sの昇順の数字の炭化ケイ素紙で切片を研削します。 切片をダイヤモンドペーストと特定の衣服で研磨します:布を3 μm Mol B3ダイヤモンド溶液で1分間研磨し、フリース布を1 μm Nap B1ダイヤモンド溶液で1分間研磨します。 切片を二重蒸留水ですすぎ、綿棒でダイヤモンド粒子を洗い流します。窒素ガスで切片を乾燥させます。 厚手部(カーボン膜厚10nm)にカーボンコーティングを施し、アルミスタブにシルバー塗装で実装します。セクションの上部とスタブの間に銀色のペイントブリッジを作成して、電子の帯電を地面に避難させます。 スタブをSEMステージに置きます。サンプルの隣に、カーボン、アルミニウム、およびシリコン標準物質を含むファラデーカップで構成されたコントロールスタブをSEMチャンバーに挿入します。これは、電子ビームを較正し、グレーレベルをCaのパーセンテージに変換するために使用されます。 電子ビームをオンにし、SEMパラメータを調整して反射電子モードで動作します。後方散乱画像では、カーボン規格のグレー レベルは 25、アルミニウム規格は 225、シリコン規格は 253 です。指標として、使用されるシステムでは、SEMパラメータは加速電圧20 keV、ファラデーカップで測定されたプローブ電流:250 pA、作動距離:15 mm、絞り:30 μm、画像解像度:1024 x 768ピクセル、真空:< 4.10-4 Pa、100 μs/ピクセルの滞留時間、明るさ~38、コントラスト~72です。 SEMが標準で校正されたら、反射電子モードで試料の画像を取得します。 試料の後方散乱電子像を使用して、Roschger et al.16で説明されているように、グレーレベルをカルシウム含有量に変換します。これは、任意の画像解析ソフトウェアを使用して実行します。 カルシウム含有量の分布をプロットします。カルシウム含有量分布は、ガウス分布を示します。関心のある3つの主要なパラメータが計算されます:Ca平均は画像上の平均カルシウム含有量、Caピーク は画像上で最も頻繁に遭遇するカルシウム濃度、Ca幅 はカルシウム含有量分布の半値での全幅です。注:qBEiの再現性は、同じ関心領域を5日間連続して(1日1回取得)イメージングすることで調査しています。これは、セッション間で電子ビームがオンとオフになったことを意味します。Ca平均、Caピーク、およびCawidthの誤差率は、それぞれ0.5%、0.7%、および1.2%と推定されました。カルシウム含有量は、エネルギー分散型X線分析(EDS)によっても調査されました。Ca平均 とEDSによって推定されたカルシウム含有量との間には、R²値が0.99で、以前にRoschgerらによって得られたデータと同様に、非常に良好な線形関係が確立されました17。 6.組織学 各サンプルについて、タングステンブレード18,19を備えた硬組織ミクロトームを使用して7μm切片を切断する。自動染色システムを使用して、Goldnerトリクローム、HES、およびMOVAT染色で切片を染色します。 脱可塑化のために、サンプルをアセトンに5分間連続して浸し、2回繰り返します。サンプルを蒸留水で5分間すすぎ、2回繰り返します。 以下に説明するようにGoldner Trichromeの着色を行います。サンプルをヴァイゲルト鉄ヘマトキシリンに20分間入れます。水道水で洗ってください。サンプルを0.5%酸性アルコールに30秒〜1分間浸漬します。水道水で20分間洗ってください。 サンプルをポンソー/フクシン酸/アゾフロキシン溶液に5分間入れます。1%酢酸に1分間浸漬します。 ホスホモリブデン酸/オレンジG溶液で20分間染色します。1%酢酸に1分間浸漬します。 ファストグリーン溶液で室温で15分間、または60°Cで8分間染色します。 水道水で十分にすすいでください。3回繰り返します。 以下に説明するように、Movatペンタクロームの着色を行います。アルシアンブルー染色:サンプルをアルシアンブルー溶液に30分間浸漬します。サンプルを水道水で5分間すすぎます。サンプルをアルカリ性エタノールに60分間入れます。サンプルを水道水で10分間すすぎます。蒸留水で最後のすすぎを行います。 Weigert ヘマトキシリン染色:サンプルを Weigert のフェリックヘマトキシリンに 20-30 分間置きます。サンプルを水道水で15分間すすぎます。蒸留水で再度すすいでください。 クロセインブリリアント/フクシン酸による染色:サンプルをクロセインブリリアント/アシッドフクシンの溶液に10分間浸漬します。0.5%酢酸ですすいでください。サンプルを5%リンタングステン酸溶液に20分間浸漬します。0.5%酢酸で2分間すすぎます。100%エタノールで3回連続してすすぎを行い、それぞれ5分間持続します。 Safran du Gatinaisによる染色:Safran du Gatinaisにサンプルを15分間置く。水道水で最後のすすぎを行います。 以下で説明するようにHESカラーリングを実行します。Weigertのヘマトキシリンによる染色:サンプルをWeigertのヘマトキシリンに30分間浸漬します。水道水で2分間すすいでください。 脱色:サンプルを塩酸アルコールに10秒間浸します。水道水で2分間すすいでください。 中和:サンプルを炭酸リチウム溶液に1分間浸します。水道水で2分間すすいでください。蒸留水で1分間最後のすすぎを行います。 エオシン-エリスロシンによる染色:サンプルをエオシン-エリスロシン溶液に3分間置きます。水道水で10秒間すすぎます。 脱水症:サンプルを95%アルコールに15秒間浸します。100%アルコールに15秒間移します。100%アルコールに浸して30秒間繰り返します。 アルコール性サフラニンによる最終染色:サンプルをアルコール性サフラニンに10分間浸漬します。水道水で最後のすすぎを行います。 スライド取付けは、以下の手順で行ってください。サンプルを95%エタノール、次に100%エタノール、次にメチルシクロヘキサンですすぎ、ステップごとにこれを3回繰り返します。 取り付けキットを使用してサンプルをマウントし、カバースリップを追加します。デジタルスライドスキャナーを使用して画像をスキャンします。 7. 顕微ラマン分光法 ラマン分析に使用したのと同じ切片をSEMと同じ切片を使用します。ステップ5.2〜5.3の説明に従って切片を短時間研磨および研磨し、サンプルからの熱放散を損なうSEM用添加の薄いカーボン層を取り除きます。 セクションをラマンマイクロスペクトロメーターのステージに置きます。波数を校正して精度を確保し、測定前にレーザーを位置合わせします。このような手順は各機器に固有のものであるため、この記事では説明しません。 分析が必要な組織内の関心領域を特定します。分析するゾーンをビデオツールの中央に配置し、次のパラメータでラマンスペクトルを収集します:30 mWで使用される785 nmレーザー、積分時間:20秒を3回繰り返し、スペクトル範囲:350-1800 cm-1、格子1200ライン/ mm。 同じラマン設定で包埋樹脂のスペクトルを10個収集し、それらを平均化します。これを使用して、手順7.6のレジンの寄与分を差し引きます。 蛍光、ノイズ、および樹脂の寄与を除去するために、次のようにスペクトルを前処理します:5次多項式フィッティングによるベースライン補正、次数4のSavitzky-Golayフィルター、17〜21のウィンドウサイズ、樹脂の~812 cm-1 ピークを使用したデジタル樹脂減算。このような前処理は、データ分析と視覚化用に設計されたさまざまなソフトウェアで実行できます。 前処理されたスペクトルをさらに解析し、対象の振動のピーク強度を基準振動のピーク強度と比べて、貴重なパラメータを抽出します。たとえば、ボーン解析の場合は、次のパラメータを使用して計算します。鉱物とマトリックスの比率:~960 cm-1 での v1PO4 振動のピーク強度を、Amide I (~1668 cm-1)、Amide III (~1250 cm-1)、CH2-wag (~1450 cm-1)、またはプロリン (~854 cm-1) とヒドロキシプロリン (Hyp、~872 cm-1) 振動モードの合計で割ります。~430 cm-1 に位置する v2PO4、または~600 cm-1 に位置する v4PO4 も使用でき、Amide III 振動20 と比べることができます。これらのパラメータは、骨基質の有機相の石灰化の程度を表します。 炭酸塩/リン酸塩:~1070 cm-1 にある v1CO3 のピーク強度を v1PO4 で割ります。これは、アパタイト格子におけるB型炭酸塩置換の量を表しています。Hyp/Proはヒドロキシプロリン含有量、~1375 cm-1/Amide IIIはプロテオグリカン含有量、~1150 cm-1/CH2-wagおよび~1495 cm-1/CH2-wagは、進行糖化最終生成物のカルボキシメチルイシンおよびペントシジンの量を表し、1670 cm-1/1690 cm-1および1670 cm-1/1640 cm-1は、コラーゲンの無秩序な二次構造(コラーゲン成熟度とも呼ばれる)を表し、I型コラーゲンのαヘリックスの形で秩序化された構造をそれぞれ表しています。 ラマン測定の再現性を評価するには、5回連続した取得(1日1回取得)で同じ関心領域を調べます。解析した各パラメータについて、分散はパラメータ値の0.2%未満であり、良好な再現性を裏付けていました。調査した各ピークの特異性については、この分野で広く議論されており、その概要は最近のUnal21のレビューで紹介されています。 8. ナノインデンテーション 注:ナノインデンテーションの破壊的な性質のため、通常、サンプル分析ルーチンの最後に実行されます。私たちが所有しているナノインデンテーションシステムには、ピラミッド型のバーコビッチダイヤモンド圧子が装備されています。しかし、圧子の形状はいくつか存在し、骨や生体材料の標本については文献でコンセンサスが得られていません。 ナノインデンテーション試験の前に、埋入した骨標本を生理食塩水でRTで16時間水和させます。 溶融シリカを使用してナノインデンテーションシステムを較正し、結果として生じるインデンテーション弾性率を記録します。溶融シリカの場合、押し込み弾性率はポアソン係数0.17で約72GPaです。 ナノインデンテーションシステムのキャリブレーションが完了したら、ラマン分析に使用するサンプルをナノインデンテーションデバイスの光学系に配置して、ナノインデンテーションが実行される場所を指摘します。注:このモダリティは機器によって異なります。ナノインデンテーションシステムとソフトウェアがどのように機能するかについては詳しく説明しませんが、実行すべきさまざまなステップについて一般的なアドバイスを提供します。 ナノインデンテーションの位置が決まったら、試料をインデンテーションデバイスの下に移動させ、インデンテーションを行います。900 nmの一定の深さでナノインデンテーションを行い、ローディング/アンロード速度は40 mm/minで、ローディングとアンローディングの間に15秒の一時停止が必要です。骨組織のポアソン係数を 0.3 に設定します。 ナノインデンテーション曲線からさまざまなパラメータを取得し、Oliver と Pharr の理論22 に従って計算します。圧痕弾性率(EIT)は、圧痕先端の既知の特性と縮小弾性率から導き出され、試験片の局所弾性率を組み合わせます。インデントを次のように計算します。ここで、vs、vi、Ei、 および Er はサンプルのポアソン係数を表し、骨は 0.3 と仮定し、ダイヤモンド圧子のポアソン係数は 0.07 と仮定し、ダイヤモンド圧子の弾性率は 1140 GPa に固定され、縮小弾性率は次のように計算されます。ここで、S は除荷セグメントの傾きを表し、Ap は投影面積で、次のように計算されます。 硬度(HIT):亀裂の開始と伝播に対する骨の抵抗に対応します。つまり、骨の靭さの指標です。コンピューティング HIT を次のように設定します。 インデンテーションクリープ率(CIT):これは、一定の荷重での骨の経時的な変形を反映しており、試験片の粘弾性特性を示し、次のように計算されます。 最大荷重(Lm):これは、指定された深さまで石灰化骨マトリックスに浸透するために必要な反対荷重に対応します。 インデンテーションワーク(Wプラスト):これは、荷重/無負荷変形曲線の下の領域に対応します。これは、塑性変形を誘発するために放散されるエネルギーの直接的な反射です。注:ナノインデンテーションの再現性は、この方法論の破壊的な性質のために、骨サンプルでの評価がより困難です。それにもかかわらず、標準試料および均一な石英ガラス試料の再現性を推定しました。上記のすべてのパラメータについて、分散は0.26%未満と推定され(5日間に5回連続して測定)、非常に良好な再現性を裏付けています。一方、骨サンプルの異方性の性質により、その再現性を評価することはより困難です。

Representative Results

外植片のマイクロCT画像を 図2に示します。手動セグメンテーションでは、グローバル閾値を使用して、中央管に存在するセメントから骨を最適に分離することはできません。海綿骨やセメントの認識を向上させるために、深層学習の活用を提案します。ディープラーニングは、生体材料の特性を認識するのに強力であり、骨とセメントの分離?…

Discussion

骨欠損の修復は、罹患者様の可動性を回復し、痛みを軽減し、生活の質を向上させるための再生医療における大きな課題です。外植片モデルの使用は、骨欠損修復の研究のためのin vivo研究と比較して多くの利点を提供します。倫理的な考慮事項に加えて、このモデルでは、実験条件の厳密な制御と生物学的変動性の減少が可能になり、より正確で再現性のあ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SC3M(SFR Francois Bonamy (UMS 016)、ナント大学)、SFR ICAT(アンジェ大学)、BIO3、HiMolA、SC4BIOなど、検体の収集と処理に携わった技術施設に感謝します。Inserm UMR_S 1229 RMeSは、フランス政府からInserm、Nantes Université、Univ Angers、Oniris VetAgroBioの各機関を通じて助成金を受けています。CLはHTLバイオテクノロジーにも感謝しています。

Materials

0.20 filters VWR  28145-501
18 G needle (1,2×40 mm) Sterican 4665120
3 mL syringe HENKE-JECT 8300005762
37% hydrochloric acid  VWR  1.00317.1000 
Acetic acid (glacial)  Sigma  A6283 
Acetone  VWR  20063-365 
Alcian Blue 8GX VWR  361186
Ammonium hydroxide VWR  318612
Apatitic tricalcium phosphate  Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France) TV26U 
Azophloxine Sigma  210633
Benzoyl peroxide Sigma  8.01641.0250
BMP2 Medtronic  InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein  Aldrich  2107507
CTVox  Bruker
DataViewer  Skyscan
Diamond blade Struers MOD13
Diamond saw Struers Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution Struers 40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution Struers 40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) Sigma  102404598
Dibutyl Phtalate Chimie-Plus Laboratoires 28656
DragonFly software  ORS 2022.1.0.1231. 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate ThermoFisher Scientific 31966-021
Eosine Y- Surgipath  Sigma  1002830105
Erythrosin B Sigma  102141057
Ethanol absolute VWR  20820362
Eukitt  Dutscher 6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL Sarstedt 62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)  Merck  1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)  Eurobio CVFSVF00
Fuchsine acid Merck  1.05231.0025 
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biosera MS01NG100J
Hematoxylin Sigma  86.118.9 
Isostatic press Nova Suisse Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry  Malvern Mastersizer 3000
Light green Prolabo  28947135
Lithium carbonate Sigma  A13149 
MD-Mol polishing cloth Struers 40500077
Methylcyclohexane VWR  8.06147.1000 
Methylcyclohexane  VWR  8.06147.1000 
Methylcyclohexane  VWR  8.06147.1000 
Methylmethacrylate Sigma  8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner  Bruker Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4) Sigma  71496
Mortar Fritsch  Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin Sigma  803060
Nanoindentation station Anton Paar NHT2
ND-Nap polishing cloth Struers 40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm Arthrex AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm Arthrex AR-1981-08S
Orange G Ral M15
Paraformaldehyde (PFA) Sigma  P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds Polysciences, Inc 18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S) ThermoFisher Scientific 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
Phosphomolybdic acid  Sigma  221856-100 g
Phosphotungstic acid Aldrich  12863-5 
Polishing machine Sturers Dap V
Poupinel MEMMERT TV26U 
Raman microspectrometer Renishaw InVia Qontor
Safran du Gâtinais  Labonord  11507737
Scanning electron microscope Carl Zeiss Evo LS 10
SEM Zeiss Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers Struers 40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint Electron microscopy sciences 12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards Micro-Analysis Consultants Ltd 8602
T25 flask Corning 430639
Xylene VWR  28975.325
Xylidine Ponceau Aldrich  19.976-1 

参考文献

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記事を引用
Lesage, C., Guihard, P., De Fourmestraux, C., Gauthier, O., Weiss, P., Guicheux, J., Mieczkowska, A., Véziers, J., Charbonnier, B., Boutet, M., Mabilleau, G. Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model. J. Vis. Exp. (211), e67235, doi:10.3791/67235 (2024).

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