提案されたプロトコルは、マルチモーダル分析を使用して骨再生の文脈で骨形成を評価するためのグローバルなアプローチを伴います。これは、新しい骨形成に関する定性的および定量的な情報を提供し、基本的および前臨床研究の厳密性と妥当性を高めることを目的としています。
骨再生の文脈における組織石灰化の広範な特性評価は、現在分析に利用可能な多数のモダリティを考えると、大きな課題を表しています。ここでは、関連する大型動物骨ex vivo 外植片を用いて、新しい骨形成を包括的に評価するためのワークフローを提案する。骨欠損(直径= 3.75 mm、深さ= 5.0 mm)が外植された羊の大腿骨頭に作成され、骨形成促進性成長因子(骨形態形成タンパク質2-BMP2)をロードしたマクロ多孔質骨代替物が注入されます。その後、外植片を28日間培養中に保持し、細胞のコロニー形成とその後の骨形成を可能にします。新たに石灰化した組織の品質と構造を評価するために、次の連続した方法が設定されます:(i)マイクロCTを使用した外植片全体の特性評価と高解像度3D画像、続いて石灰化組織の識別を強化するための深層学習画像分析。(ii)新たに形成された組織の機械的特性を決定するためのナノインデンテーション。(iii)ヘマトキシリン/エオシン/サフラン(HES)、ゴールドナートリクローム、モバットペンタクロームなどの組織学的検査により、特に骨様バリアの視覚化と骨細胞の存在に関して、石灰化組織の定性的評価を提供します。(iv)石灰化の程度を定量化し、表面形態、鉱物組成、および骨-生体材料界面に関する詳細な洞察を提供するための内部参照を使用した後方散乱走査型電子顕微鏡(SEM)マッピング。(v)ラマン分光法により、鉱化マトリックスの分子組成を特徴付け、ペプチド結合の検出を通じてセメント内のBMP2の持続性に関する洞察を提供します。このマルチモーダル分析は、新しく形成された骨の効果的な評価と、石灰化組織に対する包括的な定性的および定量的洞察を提供します。これらのプロトコルの標準化を通じて、研究間の比較を容易にし、研究成果の妥当性と信頼性を向上させることを目指しています。
骨の欠損は、外傷、腫瘍切除、先天性異常、感染などによって引き起こされるかどうかにかかわらず、再生医療にとって大きな課題となっています。これらの変化は、骨格系の構造的完全性を損ない、不快感、機能障害、および患者の生活の質の低下につながります。
これらの課題を克服するために、骨形成と骨組織再生の強化に焦点を当てた革新的な骨修復戦略が登場しました。これらのアプローチには、埋め込み型、注射用、または3Dプリント可能な骨代替物の使用が含まれ、これらは天然由来(バイオソースの高分子、動物由来のヒドロキシアパタイトなど)または合成(バイオグラス、リン酸カルシウムなど)1です。骨再生を誘導し刺激する骨の生来の低能力を強化するために、骨代替物に骨形成タンパク質(BMP)などの骨誘導因子を充填して、前駆細胞の骨形成分化を促進し、骨形成を促進することができます2。
骨形成は、コラーゲンマトリックスの初期形成に基づいており、その後、ヒドロキシアパタイト結晶によって石灰化され、それによって骨構造3が強化されます。このプロセスにより、骨に特定の剛性と強度が与えられます。石灰化組織の品質は、その微細構造属性と石灰化の程度によって複雑に支配されます4。この品質は、骨の治癒と再生された骨5の機能において極めて重要な役割を果たします。しかし、骨の石灰化を特徴づけることは、多変量研究6,7,8における固有のばらつきのために、依然として困難な課題である。
さらに、骨移植代替物の生体適合性、細胞適合性、および分化の可能性の初期評価は、通常、 in vitroで実施されます。しかし、方法論的な格差が、アウトカムのシームレスな比較を妨げています。さらに、これらの in vitro 研究は、骨再生プロセスの調節に不可欠な骨髄細胞を含む細胞集団間の多細胞相互作用と複雑な相互作用を完全には捉えていません9。骨微小環境の正確な表現の欠如は、その後の前臨床研究10の精度を損なう可能性があります。
in vivo評価は、生理学的状況をより正確に表現しますが、倫理的、ロジスティック、および財政的な考慮事項によって制約されます。したがって、ex vivo評価は、in vitro研究とin vivo研究の間のインターフェースとして極めて重要な役割を果たし、生きた被験者11,12,13の実験に進むための必要な中間ステップとして機能します。
これに関連して、再生された骨組織の品質を評価し、前臨床モデルに移行する前に戦略の関連性を確保するためには、包括的な特性評価手法の実装が必要です。そこで、ヒツジの膝関節組織を用いた外植片モデルの解析に基づくプロトコールを提案する。この革新的な方法論では、BMP2を充填したセメントを外植片に埋め込み、28日間の培養後に組織の石灰化を詳細に分析します。
この研究で採用された技術的アプローチは多様で補完的であり、再生された骨組織の品質を評価するための包括的なアプローチをまとめて提供します(図1)。高解像度のマイクロCTイメージングにより、骨構造の詳細な3D視覚化が可能になり、新しく形成された組織のミネラル密度、形態、完全性に関する貴重な洞察が得られます。この手法は、骨再生の有効性を評価し、経時的な石灰化の進行を監視するために重要です。ナノインデンテーションは、組織の硬さや強度など、組織の機械的特性を決定するための正確なアプローチです。この方法では、ナノメートルスケールで加えられた力に対する材料の応答を測定することにより、石灰化組織の堅牢性と品質を評価できます。ヘマトキシリン/エオシン/サフラン(HES)、ゴールドナートリクローム、モバットペンタクロムなどの一般的な染色法を用いた組織学的検査は、組織の構造と組成に関する貴重な洞察を提供します。これらの染色により、細胞、細胞外マトリックス、ミネラル沈着物など、さまざまな組織成分の分化が可能になり、骨再生プロセスの包括的な定性的評価が可能になります。後方散乱走査型電子顕微鏡(SEM)マッピングは、サンプルの表面を高解像度で可視化し、骨基質の石灰化の程度や、埋め込まれた材料と宿主組織との間の界面の詳細な分析を可能にします。最後に、ラマン分光法は、特にタンパク質、脂質、ミネラルなどの特定の成分の同定を通じて、組織の分子組成に関する情報を提供します。このアプローチにより、鉱化マトリックスの特性評価とBMP2などの成長因子の検出が可能になり、再生培地における骨形成促進性刺激の持続性に関する重要な情報が得られます。
私たちの研究は、さまざまな分析技術を統合した学際的なアプローチを使用して、再生された骨組織の品質の徹底的かつ包括的な評価を提供することを目指しており、したがって、骨移植代替物の評価とその潜在的な臨床応用のための強固な基盤を提供します。
骨欠損の修復は、罹患者様の可動性を回復し、痛みを軽減し、生活の質を向上させるための再生医療における大きな課題です。外植片モデルの使用は、骨欠損修復の研究のためのin vivo研究と比較して多くの利点を提供します。倫理的な考慮事項に加えて、このモデルでは、実験条件の厳密な制御と生物学的変動性の減少が可能になり、より正確で再現性のあ?…
The authors have nothing to disclose.
SC3M(SFR Francois Bonamy (UMS 016)、ナント大学)、SFR ICAT(アンジェ大学)、BIO3、HiMolA、SC4BIOなど、検体の収集と処理に携わった技術施設に感謝します。Inserm UMR_S 1229 RMeSは、フランス政府からInserm、Nantes Université、Univ Angers、Oniris VetAgroBioの各機関を通じて助成金を受けています。CLはHTLバイオテクノロジーにも感謝しています。
0.20 filters | VWR | 28145-501 | |
18 G needle (1,2×40 mm) | Sterican | 4665120 | |
3 mL syringe | HENKE-JECT | 8300005762 | |
37% hydrochloric acid | VWR | 1.00317.1000 | |
Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
Acetone | VWR | 20063-365 | |
Alcian Blue 8GX | VWR | 361186 | |
Ammonium hydroxide | VWR | 318612 | |
Apatitic tricalcium phosphate | Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France) | TV26U | |
Azophloxine | Sigma | 210633 | |
Benzoyl peroxide | Sigma | 8.01641.0250 | |
BMP2 | Medtronic | InductOs 1.5 mg/mL | |
Brillant crocein | Aldrich | 2107507 | |
CTVox | Bruker | – | |
DataViewer | Skyscan | – | |
Diamond blade | Struers | MOD13 | |
Diamond saw | Struers | Accutom-50 | |
DiaPro Mol B3 diamond solution | Struers | 40600379 | |
DiaPro Nap B1 diamond solution | Struers | 40600373 | |
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma | 102404598 | |
Dibutyl Phtalate | Chimie-Plus Laboratoires | 28656 | |
DragonFly software | ORS | 2022.1.0.1231. | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
Eosine Y- Surgipath | Sigma | 1002830105 | |
Erythrosin B | Sigma | 102141057 | |
Ethanol absolute | VWR | 20820362 | |
Eukitt | Dutscher | 6.00.01.0003.06.01.01 | |
Falcon 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | |
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O) | Merck | 1.03943.0250 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF00 | |
Fuchsine acid | Merck | 1.05231.0025 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biosera | MS01NG100J | |
Hematoxylin | Sigma | 86.118.9 | |
Isostatic press | Nova Suisse | Pmax 1500 bars | |
Laser diffraction granulometry | Malvern | Mastersizer 3000 | |
Light green | Prolabo | 28947135 | |
Lithium carbonate | Sigma | A13149 | |
MD-Mol polishing cloth | Struers | 40500077 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylmethacrylate | Sigma | 8.00590.2500 | |
Micro-CT, micro-scanner | Bruker | Skyscan 1272 | |
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4) | Sigma | 71496 | |
Mortar | Fritsch | Pulverisette 6 | |
N,N, Dimethylanilin | Sigma | 803060 | |
Nanoindentation station | Anton Paar | NHT2 | |
ND-Nap polishing cloth | Struers | 40500080 | |
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm | Arthrex | AR-1981-04S | |
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm | Arthrex | AR-1981-08S | |
Orange G | Ral | M15 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Peel-a-way disposable embbedding moulds | Polysciences, Inc | 18646C-1 | |
Penicillin/Streptomycin (P/S) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphomolybdic acid | Sigma | 221856-100 g | |
Phosphotungstic acid | Aldrich | 12863-5 | |
Polishing machine | Sturers | Dap V | |
Poupinel | MEMMERT | TV26U | |
Raman microspectrometer | Renishaw | InVia Qontor | |
Safran du Gâtinais | Labonord | 11507737 | |
Scanning electron microscope | Carl Zeiss | Evo LS 10 | |
SEM | Zeiss | Carl Zeiss Evo LS10 | |
SiC foils/Grinding papers | Struers | 40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000) | |
Silver paint | Electron microscopy sciences | 12686-15 | |
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards | Micro-Analysis Consultants Ltd | 8602 | |
T25 flask | Corning | 430639 | |
Xylene | VWR | 28975.325 | |
Xylidine Ponceau | Aldrich | 19.976-1 |