概要

小脳器官型培養物を用いたプルキンエ細胞のDNA損傷応答の可視化

Published: December 27, 2024
doi:

概要

小脳プルキンエ細胞(PC)は、DNA損傷応答の欠損に対して特に敏感です。DNA損傷に対するPC応答のダイナミクスを視覚的に評価するためのプロトコルが提示され、これには小脳器官型培養内のタンパク質結合ポリ(ADP-リボース)鎖の染色が含まれます。

Abstract

小脳プルキンエ細胞(PC)は、高い代謝率、特異的なクロマチン構造、および広範な転写活性のユニークな相互作用を示し、DNA損傷に対して特に脆弱です。これには、PCの機能不全や喪失によって引き起こされることが多い小脳変性を防ぐために、効率的なDNA損傷応答(DDR)が必要です。顕著な例は、進行性のPC枯渇と小脳の悪化を特徴とするゲノム不安定性症候群である毛細血管拡張性運動失調症(A-T)です。PCのDDRメカニズムを調べることは、このような疾患におけるPCの変性につながる経路を解明するために不可欠です。しかし、 in vitro でのPCの単離と培養の複雑さは、長い間研究努力の妨げとなってきました。マウス小脳器官型(スライス)培養は、 in vivo 組織環境を密接に模倣した実行可能な代替手段を提供します。しかし、このモデルは、顕微鏡イメージングに適したDDRインジケーターに制約されています。私たちは、タンパク質結合ポリ(ADP-リボース)(PAR)鎖の蛍光イメージング、迅速かつ早期のDDR指標が、遺伝毒性ストレスに応答して、これらの培養内のPCのDDRダイナミクスを効果的に明らかにすることを示し、器官型培養プロトコルを洗練しました。

Introduction

細胞DNAの完全性は、DNA損傷物質、主に活性酸素種などの代謝副産物によって常に脅威にさらされており、細胞あたり毎日数万のDNA損傷を引き起こします1。ゲノムの安定性の持続的な維持は、細胞の恒常性維持に不可欠です2,3。この維持の基礎は、DNA損傷応答(DDR)であり、これは、他の多くの細胞プロセスを慎重に調整しながら、特定のDNA修復経路を開始する複雑な層状シグナル伝達ネットワークである4,5。DDRの欠損は、染色体の不安定性、進行性の組織劣化、成長または発達の障害、癌の素因、および特定のDNA損傷物質に対する感受性の増加を特徴とする「ゲノム不安定症候群」として一般的に現れます6,7,8,9。特に、神経変性はしばしば小脳萎縮を含み、多くのゲノム不安定症候群の明確な特徴である7,10,11,12。

常染色体劣性遺伝性疾患である毛細血管拡張性運動失調症(A-T)は、ゲノム不安定性障害13,14,15の十分に文書化された例です。この状態は、DNA二本鎖切断(DSB)に応答するDDRモビライザーとして主に知られている重要なプロテインキナーゼであるATMをコードする役割を担うATM(A-T、変異)遺伝子のヌル変異から生じます16,17。A-Tは、主に進行性の小脳変性を特徴とするマルチシステム障害として現れ、急性運動障害、免疫不全、性腺萎縮、癌の素因、および電離放射線に対する極端な感受性を引き起こします。A-Tを有する個体の培養細胞は、染色体の不安定性を示し、遺伝毒性物質、特にDSBを引き起こす薬剤15,18,19に対する感受性の増加を示します。重要なことに、ATMは他のDNA損傷の修復にも役割を果たしており、ゲノムの安定性を維持する上でのその広範な重要性を強調しています20,21,22。

ATMの多くの役割についての徹底的な研究にもかかわらず、A-Tにおける小脳変性につながる特定のメカニズムは活発な議論のトピックであり、このプロセスを解明するためにさまざまなモデルが提案されています2324252627282930。私たちのモデル28 は、A-T 患者の小脳変性がプルキンエ細胞 (PC) の機能不全と最終的な喪失から始まることを示唆しています。DNA損傷が進行する中でゲノムの安定性を維持する上でATMが重要な役割を果たすことを考えると、PCはATMがないと特に脆弱です。この脆弱性は、それらの高い代謝活性、独特のクロマチン構造、および広範な転写活性の組み合わせに起因すると考えています。最終的に、PC機能の喪失、したがってそれらの変性は、遺伝子の確率的、機能的不活性化、すなわち欠陥のある転写産物を産生した結果によるものであることが示唆されている28

研究室でのPC生物学の研究は、単離されたPCの培養における課題によって妨げられており、これらの細胞は生存と機能のために自然環境と隣接する細胞に大きく依存しており、解離した培養成長と互換性がありません。それにもかかわらず、PCは組織スライス培養において長期間生存し続けることができます。小脳器官型培養は、典型的にはげっ歯類の小脳に由来する組織切片であり、組織の構造組織を維持し、培養細胞で可能なものと同様にさまざまな実験的操作をサポートします。したがって、これらの培養物は、制御された環境内での小脳研究を可能にする 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43 .具体的には、A-Tの文脈では、マウスの小脳器官型培養物は、Atm欠損PC40,41,42,43におけるDDRの探索に役立つことが証明されている。Atm欠損マウスは、おそらくヒトとマウスの小脳生理機能の違いにより、微妙な小脳表現型44,45,46,47しか示しませんが、ATMの役割はこれらの種全体で大部分保存されていると仮定されています。この概念は、Atm-/-マウスPCにおけるDNA DSBに対する欠損応答が、他のマウスおよびヒトATM/Atm欠損細胞型40,41,42,43で観察されたものと一致するという我々の観察によって支持されている。

器官型培養内のさまざまな刺激やストレスに対するPC応答の解析には、読み出しのために顕微鏡イメージングに頼る必要があるという制限があります。DDRは通常、バルク生化学的読み出しを使用して研究されますが、一般的な免疫蛍光マーカーも利用されます。たとえば、DSBの指標と考えられているリン酸化ヒストンH2AX(γH2AX)および53BP1タンパク質の核病巣の形成と分解能のダイナミクスを追跡するなど、48,49。より広範な尺度は、タンパク質上のポリ(ADP-リボース)(PAR)鎖形成の蛍光イメージングであり、特に鎖切断7,50に対する迅速かつ堅牢な早期DNA損傷応答です。我々は、小脳器官型培養におけるPAR染色のためのKomulainenら51によるプロトコールを変更した。PCの大きな核で顕著なPAR応答が観察されました。ここでは、マウスの小脳器官型培養を確立し、遺伝毒性ストレス下でのPAR応答を視覚化するための洗練されたプロトコルを示します。

Protocol

材料、装置、抗体の詳細については、 Table of Materials を参照してください。動物の手順は、承認後、テルアビブ大学の倫理委員会の倫理ガイドラインに基づいて採用されました。この手順は、性別に関係なく、生後10日のマウスの子犬に対して行われます。必要に応じて、前日に尾部生検と標準的な方法を用いてジェノタイピングを行います。溶液は滅菌…

Representative Results

図1は、小脳器官型培養の一般的な外観を示しています。 図1A の上段は培養で維持される小脳葉状化を示し、下段はカルビンジンD-28kで染色されたPC(緑)とNeuNで染色された神経核(赤)を示しています。 図1Bでは、PCのアストロサイト(赤)を、中間フィラメントIII型タンパク質であるGFAP(緑)について染色し…

Discussion

一般的なコメント
器官型培養システムの主な利点は、小脳皮質組織を使用した研究を容易にし、培養皿のセットアップでその構造組織を数週間保存することです。このシステムは、樹状突起スパインや超微細構造の特徴52,53,54,55,56,57,58,59の詳細な検査を含む、プルキンエ細胞(PC)の詳細な形態学的解?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちの研究室での研究は、ミリアム博士とシェルドンG.アデルソン医学研究財団とイスラエルAT病と戦うための協会によってサポートされています。

Materials

Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish Corning Inc. 3261
35 x 10 mm Petri dish Corning Inc. 3294
Acetone Invitrogen 25030081
Acetone Sigma-Aldrich 270725-1L
Adhesive microscope slides Marienfeld 48187 76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper TED PELLA Model TC752-1  Style Razor Blades
BME GIBCO 41010-026 500ml.  No L-Glut
Cell culture inserts Millipore PICM0RG50
D-Glucose Biological Indo. 02-015-1A
HBSS w/o phenol red Sigma-Aldrich H-1138-500L No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red Sartorius 02-015-1A
Horse serum  GIBCO 26050088 heat inactivated
Iris forceps CellPath GZX-0100-00A 130mm blunt serrated
Iris spatula F.S.T 10092-12
L-Glutamine (200 mM) Gibco 41010026
Methanol Sigma-Aldrich 322412-1L
Methanol  Sigma-Aldrich G5767
Microscope Olympus
Mounting Medium without GRIGENE. Ltd, Israel K239320A
Paraquat Sigma-Aldrich 856177-250MG Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor Tocris Bioscience, United Kingdom PDD 00017273 light sensitive 
Phosphate buffer Biological Indo. 02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates Corning incorporated CLS3516
Spare Chopping Discs  TED PELLA Model 10180-01
Tissue chopper McIlwain Model TC752 10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG  
Invitrogen
A21206 1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien Milliphore MAB3402 1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K Swant  CB300 1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit 
Anti-calbindin-D-28K Swant CB-38a 1:2000; primary ab; blocking 
Anti-pan-ADP-ribose reagent Milliphore MABE1016 1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) Cell signaling 4084 1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature

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記事を引用
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