概要

修飾された4血管閉塞によって誘発された脳虚血性昏睡モデル

Published: July 05, 2024
doi:

概要

このプロトコルは、修正された4血管閉塞法を使用して脳虚血性昏睡モデルを誘導するプロセスを説明しています。

Abstract

脳虚血による昏睡は、脳虚血の最も深刻な合併症です。4血管閉塞は、疾患研究や医薬品開発のための脳虚血性昏睡モデルを確立することができます。ただし、一般的に使用される4血管閉塞法では、主に首の後ろにある最初の頸椎の両側翼状孔に電気凝固ペンを挿入して、椎骨動脈を電気凝固します。このプロセスは、不完全な電気凝固、出血、および脳幹と脊髄の損傷のリスクを伴います。手術の24時間後、再麻酔をかけたラットは首の前で頸動脈結紮術を受けます。2回の手術では、ラットは感染のリスクが高くなり、実験期間が長くなります。この研究では、1 回の外科的処置中に、椎骨動脈が最初の頸椎を貫通する重要な部位を特定するために、前方頸椎切開が使用されました。両側椎骨動脈は視覚条件下で電気焼灼されましたが、両側の総頸動脈は緩い結び目を配置するために分離されました。ラットの手足がけいれんし始めると、両側の総頸動脈がすぐに結紮され、虚血性昏睡を誘発しました。この方法は、2回の外科手術による感染のリスクを回避でき、成功率が高く、簡単に実施できるため、関連する開業医にとって有用な参考資料となります。

Introduction

虚血性脳損傷は、臨床診療で最も一般的な脳損傷であり、脳血管疾患の症例の約75%を占めています。虚血は重度の二次性脳損傷や疾患1,2を引き起こす可能性があり、昏睡は虚血性低酸素性脳損傷によって引き起こされる最も重篤な症状です。また、多くの重篤な状態3の最終的な経路でもあります。昏睡は、臨床診療では重篤で重篤な病気であり、管理が困難です4.昏睡状態が長引くほど、潜在的な危険性は大きくなります。迅速な覚醒は、状態の悪化と進行を防ぐための主要な目標です。ナロキソン注射は覚醒を促進するために幅広い臨床応用がありますが、それでもいくつかの副作用があります5。そのため、安全で効果的な覚醒促進薬の開発は喫緊の課題です。虚血性昏睡の病因を解明し、医薬品開発のためには、シンプルで操作が容易な脳虚血性昏睡モデルを確立することが不可欠である6,7,8

本研究の目的は、両側脊椎動脈 (VA) の電気凝固術と両側総頸動脈 (CCA) の一時的な結紮により、全般的な虚血性昏睡を誘発するモデルを紹介することであり、これは初心者にとって簡単で使いやすいものです。以前のプロトコルでは、最初の手術中に最初の後部頸椎の両側翼状突起孔を露出させ、翼状突起孔を電気的に燃焼させて両側の VA をブロックする必要がありました。24時間後に2回目の手術が行われ、両側CCA9,10,11,12のライゲーションにより全虚血性昏睡を誘発した。しかし、目に見えないため、不完全な電気凝固、出血、脳幹、脊髄損傷のリスクがあり、実験期間が長引くリスクがあります。したがって、これらの問題に対処する必要があります。

ここでは、虚血性昏睡をモデル化するための改良された方法を紹介します。主な手順には、正中頸部を切開し、視覚条件下で両側のVAの電気的切除を行い、1回の手術で両側のCCAを短時間結紮して脳全体への血液供給を遮断し、急速な脳波(EEG)阻害を引き起こし、昏睡を引き起こすことが含まれます。この方法はまた、再灌流後に短時間の連続的な昏睡を誘発する。この手順は、実施が簡単で、初心者にやさしく、動物の二次外傷感染のリスクを減らし、それによって実験期間を短縮します。

このプロトコルは、心停止によって引き起こされる全体的な虚血性昏睡の研究に適しています。また、主に海馬の脳領域が虚血に非常に敏感であるため、虚血性認知症の研究にも理想的です。したがって、一過性脳虚血は、海馬ニューロンの損傷または喪失さえも引き起こし、認知機能障害をもたらす可能性がある13。したがって、このプロトコルは、脳虚血、虚血性昏睡、および虚血性認知症を研究する開業医に参考を提供することができます。

Protocol

実験プロトコルは、佛山大学の実験動物の使用および施設動物の管理および使用委員会の要件に従って実施されました(記録番号:2023-643656)。この研究には、雄のSprague Dawley(SD)ラット(200 g±20 g、6〜8週齢)を使用しました。すべての動物実験データは、ARRIVE(Animal Research: Reporting In Vivo Experiments)ガイドラインに従って作成されています。本試験で使用した試薬および機器の?…

Representative Results

電極の埋め込みによる炎症などの刺激により、脳波が不安定になる可能性があるため、ラットは3日間回復する必要があります。3日後に脳波とEMGが正常なラットは、昏睡モデルの準備に含めることができます。ラットに麻酔をかけたところ、脳波と筋電図の活動はわずかに抑制されましたが、スムーズに進行しました。電気凝固術が両側のVAをブロックした後、EEGお?…

Discussion

4血管閉塞は、全体的な虚血性および低酸素性脳損傷を誘発し、急性昏睡、心停止、窒息、ショック、重度の不整脈、および臨床診療における脳虚血によって引き起こされるその他の重大な臨床状態をシミュレートすることができます。一方、4血管閉塞は、主に海馬17,18において損傷を引き起こす可能性があり、これは認知…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学基金会(82173781および82373835)、ポスドク研究プロジェクト(BKS212055)、佛山科学技術局の科学技術イノベーションプロジェクト(2320001007331)、広東省基礎応用基礎研究基金会(2019A1515010806)、広東省の一般大学の主要フィールドプロジェクト(インテリジェント製造)(2020ZDZX2057)、および一般科学研究プロジェクト(特性イノベーション)の支援を受けました。広東省の大学(2019KTSCX195)。

Materials

16 channel microfiber photoelectrode array Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd 2605
4-0 Surgical suture Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd. B-104
6-0 Surgical suture Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd. JM1216-742417
EEG electrode Kedou Brain machine Technology Co., LTD KD-EEGEMG
Electrocoagulation pen CONPUVON Company 465
Lunion Stage Automatic Sleep Staging System Shanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd. 1336
Miniature hand-held skull drill Rayward Life Technology Co., Ltd 87001
Penicillin sodium Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. 17121709-2
SD rats SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd. 180-220g
Skull nail GLOBALEBIO,LTD /
Stereotaxic instrument Rayward Life Technology Co., Ltd 68801
Zoletil 50 Vic Trading (Shanghai) Co., LTD BN 88SHA

参考文献

  1. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
  2. Rong, M., et al. A modified model preparation for middle cerebral artery occlusion reperfusion. J Vis Exp. 207, e67060 (2024).
  3. Hoesch, R. E., Koenig, M. A., Geocadin, R. G. Coma after global ischemic brain injury: Pathophysiology and emerging therapies. Crit Care Clin. 24 (1), 25-44 (2008).
  4. You, W., et al. Amplitude-integrated electroencephalography predicts outcome in patients with coma after acute brain injury. Neurosc Bull. 34 (4), 639-646 (2018).
  5. He, F., Jiang, Y., Li, L. The effect of naloxone treatment on opioidinduced side effects A meta-analysis of randomized and controlled trails. Medicine (United States). 95 (37), e4729 (2016).
  6. Shukla, D. Description of coma and coma arousal therapy in Caraka Sahitā and its corollary in modern medicine. Neurol India. 65 (2), 250-252 (2017).
  7. Cossu, G. Therapeutic options to enhance coma arousal after traumatic brain injury: State of the art of current treatments to improve coma recovery. Brit J Neurosurg. 28 (2), 187-198 (2014).
  8. Li, J., Cheng, Q., Liu, F. K., Huang, Z., Feng, S. S. Sensory stimulation to improve arousal in comatose patients after traumatic brain injury: a systematic review of the literature. Neurol Sci. 41 (9), 2367-2376 (2020).
  9. Pulsinelli, W. A., Levy, D. E., Duffy, T. E. Cerebral blood flow in the four-vessel occlusion rat model. Stroke. 14 (5), 832-834 (1983).
  10. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 10 (3), 267-272 (1979).
  11. Plaschke, K., et al. Pronounced arterial collateralization was induced after permanent rat cerebral four-vessel occlusion. Relation to neuropathology and capillary ultrastructure. J Neural Transm. 110 (7), 719-732 (2003).
  12. Sugio, K., Horigome, N., Sakaguchi, T., Goto, M. A model of bilateral hemispheric ischemia- modified four-vessel occlusion in rats: To the editor. Stroke. 19 (7), 922 (1988).
  13. Sadelli, K., et al. Global cerebral ischemia in rats leads to amnesia due to selective neuronal death followed by astroglial scar formation in the CA1 layer. Neurobiol Learn Mem. 141, 168-178 (2017).
  14. Song, B. W., et al. 1H-pyrrole-2,5-dione-based small molecule-induced generation of mesenchymal stem cell-derived functional endothelial cells that facilitate rapid endothelialization after vascular injury. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 174 (2015).
  15. Sun, W., et al. A modified four vessel occlusion model of global cerebral ischemia in rats. J Neurosci Methods. 352, 109090 (2021).
  16. Xiaobing, J., et al. Modifying the four vessel occlusion to establish ischemic brain injury coma model in rats. Sichuan Med J. 29 (4), 384-386 (2008).
  17. Wang, W., et al. Levodopa improves cognitive function and the deficits of structural synaptic plasticity in hippocampus induced by global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Front Neurosci. 14, 586321 (2020).
  18. Zhan, L., Lu, X., Xu, W., Sun, W., Xu, E. Inhibition of MLKL-dependent necroptosis via downregulating interleukin-1R1 contributes to neuroprotection of hypoxic preconditioning in transient global cerebral ischemic rats. J Neuroinflammation. 18 (1), 97 (2021).
  19. Konaka, K., Miyashita, K., Ishibashi-Ueda, H., Naritomi, H. Severe hyperthermia caused by four-vessel occlusion of main cerebral arteries. Internal Med. 48 (24), 2137-2140 (2009).
  20. Ferreira, E. D. F., Romanini, C. V., Mori, M. A., de Oliveira, R. M. W., Milani, H. Middle-aged, but not young, rats develop cognitive impairment and cortical neurodegeneration following the four-vessel occlusion/internal carotid artery model of chronic cerebral hypoperfusion. Eur J Neurosci. 34 (7), 1131-1140 (2011).
  21. Ma, B., et al. Protective effects of extract of Coeloglossum viride var. bracteatum on ischemia-induced neuronal death and cognitive impairment in rats. Behav Pharmacol. 19 (4), 325-333 (2008).
  22. Song, Y. Y., Chen, Y. H., Li, J. F., Sun, W. A review of animal models of vascular dementia. Chin J Comp Med. 33 (12), 75-85 (2023).
  23. Liu, B., et al. Autophagy activation aggravates neuronal injury in the hippocampus of vascular dementia rats. Neural Regen Res. 9 (13), 1288-1296 (2014).
  24. Li, J., Takeda, Y., Hirakawa, M. Threshold of ischemic depolarization for neuronal injury following four-vessel occlusion in the rat cortex. J Neurosurg Anesthesiol. 12 (3), 247-254 (2000).
  25. Rishitha, N., Muthuraman, A. Ameliorative potential of thymoquinone in four vessel occlusion induced vascular dementia in rats. Alzheimer Dement. 19 (S13), e71053 (2023).
  26. Oruc, S., et al. The antioxidant and antiapoptotic effects of crocin pretreatment on global cerebral ischemia reperfusion injury induced by four vessels occlusion in rats. Life Sci. 154, 79-86 (2016).
  27. Lu, D., et al. A modified method to reduce variable outcomes in a rat model of four-vessel arterial occlusion. Neurol Res. 38 (12), 1102-1110 (2016).
  28. Idt-Kastner, R. S., Paschen, W., Ophoff, B. G., Hossmann, K. A. A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats. Stroke. 20 (7), 938-946 (1989).
  29. McBean, D. E., Kelly, P. A. T. Rodent models of global cerebral ischemia: A comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion. Gen Pharmacol. 30 (4), 431-434 (1998).
  30. Todd, N. V., Picozzi, P., Alan Crockard, H., Russell, A. R. R. Reperfusion after cerebral ischemia: Influence of duration of ischemia. Stroke. 17 (3), 460-466 (1986).
  31. Toda, S., et al. Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia – Modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature. Acta Neurochir (Wien). 144 (12), 1297-1304 (2002).
  32. Ma, R., Lu, D., Wang, J., Xie, Q., Guo, J. Comparison of pharmacological activity and safety of different stereochemical configurations of borneol: L-borneol, D-borneol, and synthetic borneol. Biomed Pharmacother. 164, 114668 (2023).
  33. Ji, X. Y., et al. Potential targets for protecting against hippocampal cell apoptosis after transient cerebral ischemia-reperfusion injury in aged rats. Neural Regen Res. 9 (11), 1122-1128 (2014).
  34. Martínez-Alonso, E., et al. Differential association of 4E-BP2-interacting proteins is related to selective delayed neuronal death after ischemia. Int J Mol Sci. 22 (19), 10327 (2021).

Play Video

記事を引用
Ma, R., Li, R., Liang, J., Yang, H., Xie, Q., Zeng, X., Guo, J. Cerebral Ischemic Coma Model Induced by Modified Four-Vessel Occlusion. J. Vis. Exp. (209), e67161, doi:10.3791/67161 (2024).

View Video