概要

マツノザイセンチュウ Bursaphelenchus xylophilus によるIn vivoおよびIn vitroマツの感染と誘導揮発性物質の単離

Published: September 27, 2024
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概要

このプロトコルは、Pinus pinasterin vivoおよびin vitroのマツノイセンチュウ感染と、ガスクロマトグラフィー(GC)および質量分析(GC-MS)に結合されたGCによるそれらの揮発性分析について説明しています。

Abstract

マツノボブセンチュウ(PWN)は、針葉樹にマツ材萎凋病(PWD)を引き起こす植物寄生虫です。この植物寄生性線虫は、日本、中国、韓国などのアジア諸国のマツの森林破壊に大きく貢献しています。過去20年間、ヨーロッパでは、ポルトガルとスペインが大きな影響を受けてきました。感受性宿主種におけるPWN感染および/またはPWDの進行のメカニズムに関する研究は、温室条件下でのマツの苗木の制御された感染に依存しています。この手法は手間がかかり、かなりの経済的および人的資源を動員します。さらに、一部のマツ種に関連する遺伝的多様性だけでなく、外部要因の干渉からも生じる変動性が発生しやすい場合があります。別の方法として、マツとPWNのin vitro共培養は、a)単一の環境変数または栄養変数を制御でき、b)占有スペースが少なく、c)取得に必要な時間が短く、d)汚染や宿主の遺伝的変異がないため、生化学的変化を研究するためのより有利なシステムを提供します。以下のプロトコルでは、マツの揮発性物質に対するこの植物寄生虫の影響を研究するための改良された方法論として、マツマツ、ピナスター、マツ、マツ、ピナツ、ピナツ、マツ、ボラチオ、マツの揮発性物質に対する影響を研究するための改良された方法論の標準的なin vivo PWN感染を詳述しています。PWN誘導性揮発性物質は、in vivoおよびin vitroで感染したマツから水化蒸留および蒸留抽出によって抽出され、放出された揮発性物質は、繊維またはパックドカラム技術を用いた固相マイクロ抽出(SPME)によって捕捉されます。

Introduction

マツノボイセンチュウ(PWN)、 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970は、主に マツ 類に寄生する植物寄生性線虫です。この植物寄生虫は、昆虫の成熟摂食中に 、Monochamus 属の昆虫によって感受性の高いマツ種の樹木に誘導されます。PWNは、樹脂管を攻撃して樹脂の流れを減らし、血管組織を損傷して水柱を中断させることで、樹木を殺します。樹冠の水不足は、松枯れ病(PWD)の最初の目に見える症状、すなわち、光合成の停止後に松葉がクロロティックになり、乾燥により垂れ下がる原因となります。マツは一般に、樹脂と揮発性化合物の生成を通じて生物的および非生物的ストレスに反応します1。したがって、マツの防御メカニズムを理解することは、PWN攻撃の特定の影響を決定し、害虫駆除の代替方法を見つけるために重要です2

現在、野外条件下での実験は、感染したマツの利用可能性、PWN感染の確認、およびさまざまな環境条件に依存しています。温室条件下では、これらのパラメータをより簡単に制御できます。しかし、宿主の遺伝的多様性は、多様性の強力な原因となります3。例えば、Pinus pinasterの耐性応答に関する研究では、テルペンリモネンと樹脂酸の生成がPWN感染と関連していました4。しかし、サンプル数が少ないことや自然条件のばらつきにより、検出可能な変化は半数のサンプルにしか登録されませんでした。温室栽培のマツの苗木を使用した別の研究では、環境条件がより簡単に制御されたにもかかわらず、自然のマツの遺伝的多様性が抽出された揮発性物質に大きな変動を引き起こしました5。病気によって誘発されるマツの揮発性物質は、環境的および遺伝的変異によって大きく影響を受ける可能性があるため、PWN感染に対するマツ組織の化学的および生化学的応答を研究するには、in vitroシュート培養に頼ることが良い代替手段です5,6植物の遺伝子型をin vitroで増殖させることにより、その遺伝子構成を無期限に維持およびクローニングすることができ、in vivo条件よりも少ないスペースと短い時間で、より多くの遺伝的に同一の個体を確立することができます。これらの培養物は、容易に操作できる栄養および環境条件下での単純な作業システムであるため、揮発性物質7,8の生成および排出の評価において、従来のシステムにさらなる利点を提供します。これらのシステムは、ほとんどの場合、かなりのリソースを必要とする、すなわち、対象樹木が手の届きにくい場所にあることがあり、高価な機器、専任の労働力、およびより長い分析期間を必要とする木本種の研究に特に有利である8。In vitroでは、PWNとマツの共培養により、線虫と植物との間の異なる段階での代謝相互作用の評価が可能になります9。揮発性物質の分析では、プロファイリング技術が非常に正確になり、サンプリングのわずかな変動が揮発性プロファイルに大きな変化をもたらす可能性があるため、これは非常に重要です。質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー(GC-MS)は、揮発性物質の分析のための強力な技術であり、揮発性物質の迅速かつ合理的なプロファイリングを可能にします10。ここで紹介するプロトコルは、温室条件下でのin vivoマツ苗木および誘発揮発性物質の抽出およびプロファイリングに最適化された遺伝的に同一のマツのin vitroシュート培養物に感染させる技術について説明しています。

Protocol

1. インビトロ マツノイセンチュウの育成 注:マツノイセンチュウは、Botrytis cinerea(de Bary)Whetzel11の非胞子性株の真菌菌糸体を餌にして成長します。 日常的な継代培養では、菌類コロニーの最も外側の境界から培養プラグ(直径0.5 cm)を滅菌ジャガイモデキストロース寒天(PDA)のプレートに移?…

Representative Results

PWNは最適な条件下で迅速に繁殖し、生成時間は4日と短くなることがあり、各メスは生涯で約80個の卵を産みます28。上記の方法論を使用すると、真菌の増殖に応じて大量のPWNを取得できます。8 日間の成長期間内に、PWN の人口数は 100 倍に増加する可能性があります(図 1)。PWNの量の一貫性を高めるには、未知の細菌や真菌によ?…

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、PWNに感染した海産マツの揮発性化合物を分析するための強化された方法論を概説しており、環境的および遺伝的変動が減少し、結果に影響を与えません。 in vitro 海産マツ遺伝子型の純粋な系統を使用して、抽出および放出された揮発性物質を、マツ林に対する最も有害な生物的脅威の1つに対する宿主応答として分析できます。<…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、PurPestプロジェクトの下で助成金契約101060634を通じてEUから資金提供を受け、プロジェクトNemACT、DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002を通じて、Fundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT)によって部分的に資金提供されました。NemaWAARS、DOI 10.54499 / PTDC / ASP-PLA / 1108/2021;CESAM UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+ LA/P/0094/2020;CE3C、DOI 10.54499/UIDB/00329/2020;GREEN-IT、DOI 10.54499/UIDB/04551/2020 および 10.54499/UIDP/04551/2020。

Materials

38 mesh test sieve Retsch 60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP) Duchefa Biochemie B0904
Charcoal activated Duchefa Biochemie C1302
Clevenger apparatus WINZER Laborglastechnik 25-000-02
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA) Duchefa Biochemie I0902
Likens-Nickerson apparatus VitriLab LDA. c/IN29/32
Microbox round containers Sac O2 O118/80+OD118
n-Pentane Sigma-Aldrich 1.00882
PARAFILM M sealing film BRAND HS234526B-1EA
Phyto agar Duchefa Biochemie P1003
Potato Dextrose Agar BD DIFCO 213400
Scalpel blade no. 24 Romed Holland BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium Duchefa Biochemie S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture Duchefa Biochemie S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) Supelco 57300-U
SPME Fiber Holder Supelco 57330-U
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped Markes International C1-AAXX-5003

参考文献

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記事を引用
Faria, J. M. S., Figueiredo, A. C., Teixeira, D. M., Inácio, M. L. Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles. J. Vis. Exp. (211), e67149, doi:10.3791/67149 (2024).

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