概要

中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるDNA切断の検出

Published: August 23, 2024
doi:

概要

このプロトコルは、DNA複製中に発生するDNA損傷の程度を調査するように設計されています。中立条件下では、DNA切断の誘導を短時間で容易に評価できます。さらに、このプロトコルは、他の細胞タイプやさまざまな複製ストレス試薬にも適応可能です。

Abstract

DNA複製は、DNAを損傷する可能性のあるさまざまな内因性および外因性のストレッサーによって常に挑戦されています。ゲノム重複中に遭遇するこのような病変は、レプリソームを失速させ、複製フォークを二本鎖切断に変換する可能性があります。修復せずに放置すると、これらの有毒なDNA切断が染色体再配列を引き起こし、ゲノムの不安定性を高め、細胞形質転換の可能性を高める可能性があります。さらに、がん細胞は持続的な複製ストレスを示すため、腫瘍細胞の複製フォークの脆弱性を標的とすることは、化学療法の魅力的な戦略となっています。複製中のDNA切断を研究するための非常に汎用性が高く強力な手法は、コメットアッセイです。このゲル電気泳動技術は、シングルセルレベルでのDNA切断の誘導と修復を確実に検出します。ここでは、研究者が複数の細胞タイプにわたるフォークストール剤を使用してヒト細胞を有糸分裂する際のDNA損傷の程度を測定できるようにするプロトコルが概説されています。これを自動コメットスコアリングと組み合わせることで、迅速な分析が容易になり、DNA切断の誘導研究の信頼性が向上します。

Introduction

コメットアッセイは、シングルセルレベルでDNA切断を検出するために使用されるゲル電気泳動法です。これは、オープンエンドのDNA切断が電気泳動条件下で移動する一方で、無傷のDNAはほとんど静止したままであるという原理に依存しています。壊れたDNAが移動するのは、切断がスーパーコイル状のDNAの弛緩をもたらし、電気泳動チャンバー内のアノードに向かって徐々に空間的に再配置するためであり、その結果、免疫蛍光法によって観察される彗星のような外観になります1,2。次に、DNA損傷の程度は、コンパクトなDNAに対して移動した壊れたDNAの量を定量化することによって測定されます。

最も一般的に使用される2つのコメットアッセイ法は、アルカリコメット(AC)アッセイとニュートラルコメット(NC)アッセイです。ACアッセイは高アルカリ性pH溶液を使用して変性条件下で実施され、NCアッセイは中性pHの溶液で実施されます。NCアッセイとACアッセイはどちらも、核内で発生するDNA切断を確実に検出できます。しかし、アルカリ性バージョンは、アルカリに不安定なサイト3の検出にも有利である。どちらのアッセイ形式でも、電気泳動の前にDNAにタンパク質が含まれていないことを確認するために溶解条件を使用する必要があります。

このアッセイは、DNA切断を検出するための簡単な方法であり、細胞DNA損傷を決定するためのいくつかのユニークな利点を提供します。この分析法は比較的セットアップが簡単で、試薬はラボで調製するか、市販のベンダーから購入する必要があります。シングルセル分解能技術として、アッセイに必要な出発物質はほとんど必要ありません。特に、NCアッセイは高感度でブレークを測定でき、細胞あたり50〜10,000個のブレークを検出すると報告されています4。この手法の汎用性は、生態毒性学5、ヒトバイオモニタリング6、遺伝毒性試験7など、その幅広いアプリケーションによって実証されています。また、このアッセイは、さまざまな細胞タイプで信頼性を確保し、ハイスループットアッセイ8 や特定のゲノム領域での切断の評価9にも適合させることができます。したがって、このアッセイは、シングルセルレベルでのブレーク形成を調査するための迅速で信頼性の高い手法として機能します。

DNA複製のプロセスは、いくつかの内因性および外因性のストレッサー10,11によって絶えず挑戦されている。このような病変によるレプリソームの失速は、DNAの切断を引き起こし、ゲノムの不安定性を高める可能性があります。DNA切断は、DNA修復を容易にするための複製中間体としてもしばしば生じる12。さらに、いくつかの化学療法剤は、カンプトテシン(CPT)13,14,15やPARP阻害剤16,17など、複製依存性二本鎖切断(DSB)を誘導します。したがって、このアッセイは、DNA損傷の性質を研究し、複製フォークの処理を評価し、DNA損傷剤の治療可能性を調査するための強力な方法論として機能します。新たに合成されたDNAをBrdUで標識するアッセイの適応は、複製関連ストレス表現型18,19,20,21の研究に役立っています。特に、NCアッセイは、フォークタンパク質の特性評価22,23、複製中間体の分析24,25、およびゲノム維持における転写-複製競合の調査26,27を含む研究で実証されているように、複製の文脈でDNA切断誘導を研究するための信頼性の高い方法である.ここでは、ヒト細胞での複製中のDNA切断を定量化することを目的としたNCアッセイプロトコルの概要を説明します。このプロトコルは、分裂しているヒト細胞の多種多様な複製ストレス関連損傷の評価に関心のある研究者によって容易に実施できます。

Protocol

このプロトコル(図1)は、主に接着性U2OSがん細胞株を利用しますが、組織培養で増殖したさまざまな接着細胞および浮遊細胞に適応できます。この試験で使用した溶液とバッファーを 表1に示します。使用した試薬や機器は 、材料表に記載されています。 1. 資料の準備 実験の日の前に、付属のボトルに低融点アガ…

Representative Results

レプリケーションストレス試薬によるブレークインダクションの解析U2OS細胞をDMSO、4のmMヒドロキシ尿素(HU)、または100nMのCPTで4時間処理し、NCアッセイによりブレーク蓄積について分析しました(図6A)。CPTはトポイソメラーゼ-1を阻害することによりS期に切断を誘導するが13、HUによって誘発されるヌクレオチドプールの枯渇は、徐々にDSB…

Discussion

このプロトコルは、活発な複製を受けているヒト細胞のDNA切断を評価するためのNCアッセイの概要を示しています。このプロトコールは比較的簡単に実施でき、研究者はアルカリ性分析のための高pH条件に容易に適応させることができます8。これには、ステップ 3.7 と 4.5 で説明されている 2 つの重要なステップが含まれています。ステップ3.7では、分析中に彗星が重ならな?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dungrawala研究室のメンバーの意見とフィードバックに感謝します。この研究は、NIH の HD 助成金R35GM137800によって資金提供されました。

Materials

1x DPBS Gibco 14190144
Camptothecin Selleckchem S1288
Comet LMAgarose (LMA) R&D systems 4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II R&D systems 4250-050-ES Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software TriTek open-sourced
CometSlide R&D systems 4250-050-03
DMEM, high glucose Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO  FisherSci D128-4
Epifluorescence microscope Keyence BZ-X810
Fetal Bovine Serum – Premium Bio-Techne S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
GraphPad Prism 10.0 GraphPad
HEK293T cells ATCC CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells ATCC CRL-4000
Hydroxyurea Millipore Sigma H8627
PARP inhibitor Olaparib Selleckchem S8096
PowerPac  FisherSci FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate FisherSci FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x) FisherSci S7567
U2OS cells ATCC HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator FisherSci UVP95003001

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記事を引用
Nelligan, A., Dungrawala, H. Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay. J. Vis. Exp. (210), e67110, doi:10.3791/67110 (2024).

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