概要

エクソソームのローディングとデリバリーのためのマイクロニードルパッチの作製と特性評価

Published: July 12, 2024
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概要

エクソソームは大きな臨床的可能性を秘めていますが、 in vivo でのクリアランスが容易で安定性が低いため、その実用化は限られています。マイクロニードルは、生理学的バリアに穴を開け、乾燥状態の保存を行うことで局所的な送達を可能にすることで解決策を提示し、それによってエキソソーム投与の限界に対処し、その臨床的有用性を拡大します。

Abstract

エクソソームは、新たな「次世代」バイオ医薬品および薬物送達ベクターとして、薬物送達や再生医療から疾患診断や腫瘍免疫療法に至るまで、さまざまな生物医学分野で大きな可能性を秘めています。しかし、従来のボーラス注射による迅速なクリアランスとエクソソームの安定性の低さは、それらの臨床応用を制限します。マイクロニードルは、投与部位におけるエクソソームの滞留時間を延長する溶液として働き、薬物濃度を維持し、持続的な治療効果を促進します。さらに、マイクロニードルは生理活性物質の安定性を維持する能力も持っています。そこで、エクソソームをロードおよび送達するためのマイクロニードルパッチを導入し、エクソソームの単離、作製、エクソソームロードマイクロニードルパッチの特性評価などの方法を共有します。マイクロニードルパッチは、先端材にトレハロースとヒアルロン酸、バッキング材にポリビニルピロリドンを用い、2段階のキャスティング法により作製しました。マイクロニードルは堅牢な機械的強度を示し、先端は2 N.ブタの皮膚に耐えることができ、人間の皮膚をシミュレートするために使用され、マイクロニードルの先端は皮膚穿刺後60秒以内に完全に溶けました。マイクロニードルから放出されたエクソソームは、新鮮なエクソソームと同等の形態、粒子サイズ、マーカータンパク質、および生物学的機能を示し、樹状細胞の取り込みを可能にし、その成熟を促進しました。

Introduction

エクソソームは、細胞によって細胞外マトリックスに放出される小さな小胞であり、いくつかの疾患やがんの治療のための潜在的なバイオ医薬品および薬物送達ベクターとして提案されています1。その生合成過程において、エクソソームは、機能性タンパク質や核酸2など、細胞内からさまざまな生物学的に活性な分子をカプセル化します。その結果、輸送過程でレシピエント細胞に取り込まれると、エクソソームは標的細胞の遺伝子発現や細胞機能を調節する能力を持つ3。一種の天然の情報伝達者として、エキソソームは、組織再生、免疫調節、および送達キャリア4として十分に利用されてきた。工学的技術により、特定のリガンドをエクソソームの表面に濃縮し、レシピエント細胞におけるシグナル伝達イベントの誘導または阻害を可能にしたり、特定の細胞タイプを標的としたりすることができます5。化学療法剤は、がん治療のためにエクソソームに装填することもできる6。さらに、エクソソームは治療用貨物送達のために血液脳関門を通過する能力を有しており、脳疾患の治療に非常に有望である7。リポソームと比較して、エクソソームは細胞への取り込みが促進され、生体適合性が向上しています8。それらは、他の細胞に効率的に侵入すると同時に、より優れた耐性と低い毒性を示すことができる9。しかしながら、エクソソームの伝統的なボーラス注射は、血流中の肝臓、腎臓、および脾臓による隔離および迅速な除去を受けやすい10。さらに、エクソソームは in vitroでの 安定性が低く、保存条件の影響を受けやすいため、臨床応用が制限されます11

マイクロニードルは、マイクロメートルサイズの針先の配列であり、低分子薬物12、タンパク質13、核酸14、およびナノメディシン15の送達のための生理学的障壁を貫通する能力を有する。マイクロニードルは、皮膚表面の病変を標的とするように精密に設計されており、その分散した先端は標的部位での均一な薬物分布を確保し、したがってその治療効果を増幅します16。マイクロニードルの設計と材料組成は、タンパク質や核酸などの生理活性物質の乾燥保存を容易にし、それらの安定性を高めます17。従来の注射方法は、作用時間が比較的短く、痛みを引き起こし、患者に恐怖を引き起こす可能性があります18。マイクロメートルサイズの長さのマイクロニードルは、組織の外傷を最小限に抑え、神経刺激を防ぎ、それによって痛みを排除し、患者のコンプライアンスを向上させます19。さらに、マイクロニードルのユーザーフレンドリーな性質により、患者は専門の人員を必要とせずに治療を自己投与することができる16。マイクロニードルは、皮膚以外にも、眼部20、口腔粘膜部21、心臓部22、血管部23などの組織にも使用できる。エクソソームの臨床送達のためのマイクロニードルの適用は、有望で前向きな戦略を提供します。

そこで、エキソソームをロードしたマイクロニードル(exo@MN)パッチを導入し、その作製方法を開示する。マイクロニードルパッチは、遠心分離と真空乾燥の2段階のキャスティング法で作製し、マイクロニードル先端でのエクソソームの凝集を促進し、送達効率を高めました。針先と裏地はどちらも、優れた生体適合性と水溶性を示す材料を使用して構築されています。エクソソームを保護するためのチップ材料としてトレハロースとヒアルロン酸(HA)を組み込み、バッキング材料として無水エタノールに溶解したポリビニルピロリドン(PVP)を選択しました。マイクロニードルパッチの形態は、顕微鏡法および走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて特徴付けた。マイクロニードルの機械的試験は、皮膚に浸透する能力を確認するために引張計を使用して評価され、ブタの皮膚への放出率は60秒であると調査されました。さらに、新鮮エクソソームとexo@MN中のエクソソームの両方の形態、サイズ、およびタンパク質含有量を、透過型電子顕微鏡(TEM)、ナノ粒子追跡分析(NTA)、およびウェスタンブロッティング(WB)を使用して特徴付けました。樹状細胞(DC)によるエクソソームの内在化を共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いて特徴付け、DCの成熟度をフローサイトメトリーで評価しました。2種類のエクソソームの形態学的特徴と生物学的機能は基本的に一貫しています。

Protocol

セクション3に記載されている実験に使用された豚の皮膚は、実験動物から供給されたものではなく、市場から食用豚の耳として購入されたため、この研究は倫理的なクリアランスを必要としません。 1. エクソソームの単離 細胞培養直径15cmのシャーレに10%のウシ胎児血清と100×のペニシリン-ストレプトマイシン溶液(100)を含むダルベッコのModifie…

Representative Results

ここでは、エキソソームの単離、exo@MNパッチの作製および特性評価のためのプロトコルを紹介します。 図1 は、パッチの製造exo@MNプロセスフローチャートを示しています。エクソソームをトレハロースおよびHAと混合し、次いで、混合物をマイクロニードル型に添加し、遠心分離した。このプロセスにより、針先でのエキソソームの凝集が促進され、迅速な放出が促進?…

Discussion

現在、エクソソームを単離するための主な方法には、超遠心分離、密度勾配遠心分離、限外ろ過、沈殿、免疫親和性磁気ビーズ、およびマイクロ流体工学が含まれる24。マイクロニードルは針先のスペースが小さいため、ローディングキャパシティが限られているため、より多くのロードを行うためにはエクソソームの濃度を上げる必要があります。したがって、細胞培養?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

F.L.Q.は、浙江省のパイオニアR&Dプログラム(2022C03031)、中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFA0910103)、中国国家自然科学基金会(22274141、22074080)、山東省自然科学基金会(ZR2022ZD28)、山東省の泰山奨学生プログラム(tsqn201909106)の支援に感謝しています。H.C.は、中国国家自然科学基金会(82202329)からの財政支援に感謝しています。著者たちは、中国科学院杭州医学研究所(HIM)のShared Instrumentation Core Facilityで機器が使用されていることを認めている。

Materials

100x penicillin-streptomycin solutions Jrunbio Scientific MA0110 Cell culture
180 kDa pre-stained protein marker Thermo 26616 Western blotting
3% Uranyl acetate Henan Ruixin Experimental Supplies GZ02625 Morphological characterization of exosomes
3D printer BMF technology nanoArch S130 Mold preparation
4%–20% precast gel Genscript ExpressPlus PAGE GEL Western blotting
5× SDS-PAGE loading buffer Titan 04048254 Western blotting
Anti-mouse Alix antibody Biolegend 12422-1-AP Western blotting
Anti-mouse CD63 antibody Biolegend ab217345 Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibody Biolegend 104713 Antibody
Auto fine coater ZIZHU JBA5-100 Morphological characterization of microneedle
BCA assay kit Beyotime P0012 Protein concentration assay
Centrifuge Thermo Fisher Muitifuge X1R pro Cell centrifuge
Circulating water vacuum pump Yuhua Instrument SHZ-D(III) Filtration
CO2 incubator Eppendorf CellXpert C170 Cell culture
Confocal laser scanning microscope Nikon A1HD25 Fluorescence imaging
Copper mesh Beijing Zhongjingkeyi Technology  JF-ZJKY/300 Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrate Aladdin 5138-23-4 Fabrication of microneedle 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Meilunbio MA0212 Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered saline Meilunbio MA0010 Cell culture
Electrophoresis system Bio-rad PowerPac-basic Western blotting
Fetal bovine serum Jrunbio Scientific JR100 Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibody Biolegend 117305 Antibody
Flow cytometry BD LSR Fortessa Fluorescence detection
Gel imager Cytiva Amersham ImageQuant 800 Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgG CST 7074S Western blotting
HTL resin BMF technology Mold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa) Bloomage Biotechnology 9004-61-9 Fabrication of microneedle 
Immersion oil Nikon MXA22168 Fluorescence imaging
Ion cleaner JEOL EC-52000IC Morphological characterization of exosomes
Microscope Olympus CKX53 Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8 MeisenCTCC  CC90105 Cell culture
Nanoparticle tracking analysis Particle Metrix ZetaView Size analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody Biolegend 107619 Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime ST507 Protease inhibitors
Plasma cleaner Hefei Kejing Material Technology PDC-36G Fabrication of microneedle 
Polydimethylsiloxane Dow Corning 9016-00-6 Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa) Aladdin 9003-39-8 Fabrication of microneedle 
Prism  GraphPad Version 9 Statistical analysis
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Western blotting
Quick-snap centrifuge Beckman 344619 Exosomes extraction
RIPA lysis buffer Applygen C1053 Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640 Meilunbio MA0548 Cell culture
Scanning electron microscope JEOL JSM-IT800 Morphological characterization of microneedle
Stereo microscope Olympus SZX16 Characterization of morphology
Super ECL detection reagent Applygen P1030 Western blotting
Tensile meter Instron 68SC-05 Mechanical testing
Transmission electron microscope JEOL JEM-2100plus Morphological characterization of exosomes
Tris buffered saline Sangon Biotech JF-A500027-0004 Western blotting
Tween-20 Beyotime ST825 Western blotting
Ultracentrifuge Beckman Optima XPN-100 Exosomes extraction
Ultrafiltration tube Millipore UFC910096 Exosomes concentration
Vacuum drying oven Shanghai Yiheng Technology DZF-6024 Fabrication of microneedle
Vacuum filtration system Biosharp BS-500-XT Filtration

参考文献

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記事を引用
Mu, S., Chang, H., Qu, F. Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes. J. Vis. Exp. (209), e67109, doi:10.3791/67109 (2024).

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