ここでは、回転式タトゥーマシンで大人の Xenopus laevis (アフリカの爪のあるカエル)の入れ墨の方法について説明します。適切な入れ墨は、数ヶ月間持続し、研究や記録管理の目的で動物を簡単に区別できるようにする、暗くて読みやすい数字をもたらします。
動物モデルは生物医学研究の範囲を広げ、発生生物学、分子生物学、細胞生物学の理解を深め、研究者がヒトの疾患をモデル化することを可能にします。個々の動物を記録し追跡することで、研究者は研究に必要な動物の数を減らし、動物の健康を改善するための実践を洗練させることができます。哺乳類のマーキングと追跡には、耳のパンチングや耳のタグなど、いくつかの十分に文書化された方法が存在します。しかし、水生両生類の種をマーキングする方法は限られており、既存の資源は時代遅れであったり、効果がなかったり、法外に高価であったりします。この原稿では、ロータリータトゥーマシンで Xenopus laevis をマーキングする方法とベストプラクティスを概説します。適切な入れ墨は高品質の入れ墨をもたらし、研究者が個人を簡単に区別できるようにし、動物の健康へのリスクを最小限に抑えます。また、入れ墨がすぐに消えて動物に不必要な害を及ぼす可能性のある、質の悪い入れ墨の原因を強調します。このアプローチにより、研究者や獣医師は両生類に印を付けることができ、生物学的複製やトランスジェニック系統を追跡し、動物の健康状態を正確に記録することができます。
動物モデルは、人間の健康に関する問題を調査するための便利なツールです。実際には、動物モデルを用いた生物医学研究では、健康な動物コロニーを慎重に組織し、維持する必要があります。倫理的な動物の取り扱いと飼育のためのベストプラクティスは、実験に必要な動物の数を減らし、動物福祉を確保するための実践を洗練することを目的としています1。Xenopus laevis(X. laevis;アフリカツメガエル)とXenopus tropicalis(X. tropicalis;Western Clawed frog)は、1930年代に南アフリカの医師が最初の妊娠検査を行うためにX. laevisを使用して以来、生物医学研究に使用されてきました2。現代の妊娠検査薬ではカエルは不要になりましたが、Xenopus研究の役割は続いています。生物医学研究にXenopusを使用する利点には、よく注釈されたゲノム3、大量の卵の年間にわたる排卵誘発性4、体外受精に適した外部産卵などがあります。これらの特徴により、脊椎動物の発生学と発生学5,6,7、基本的な分子生物学と細胞生物学7,8,9,10、およびヒト疾患のモデリング7,11,12,13に有用な資産となっています。
個々のXenopus動物を追跡する信頼性の高い方法は、生物学的複製を記録し、研究の厳密性と再現性を向上させるために不可欠です。Xenopusはグループで飼育されることが多いため、動物マーキングにより、研究者は個々の動物を簡単に追跡できます4。動物の正確な記録を維持することで、時間とリソースを節約し、動物の健康状態を追跡する能力を向上させることができます。例えば、動物の個体同定は、トランスジェニックXenopus系統を作製するための組織化ワークフローを改善することができるが、これは、シーケンシング14によって検証された特定の遺伝子型を持つカエルの複数世代が必要であり、それには動物の組織化および個体同定が必要であるからである。これは、これらの突然変異が容易に識別できる成人の表現型を欠いている場合に特に当てはまります。同様に、Xenopusの卵母細胞と胚を使用して基本的な細胞生物学と発生生物学を研究することは、個々の動物を追跡することで有益です。排卵を誘発した後、動物は過排卵症候群などの健康上の合併症を防ぐために最低3ヶ月間休む必要がある15。個々の同定方法により、動物が頻繁に排卵するように誘導されないようにします。
また、動物のマーキングと追跡により、ラボの担当者は動物の健康上の懸念を追跡することもできます。同じ遺伝子型の動物が病気になるのは、導入遺伝子に関連する過度の近親交配または予期しない健康上の懸念を示している可能性があります。同様に、最近の排卵後に病気になった動物は、試薬、材料、または技術に問題があることを示している可能性があります。動物とその健康状態を追跡することで、研究所の担当者や獣医師は、懸念が再浮上したときにフォローアップし、将来の病気を防ぐための予防策を講じることができます。哺乳類では、多数の識別方法があります。マウスの恒久的な方法には、耳のパンチング、耳のタグ、入れ墨、および皮下マイクロチップ16が含まれる。これらは、コロニーやケージ内の動物を明確かつ確実に区別でき、実験室の担当者が簡単に投与できます。耳を打つなどの方法は、侵襲性が低く、特殊な器具を1つだけ必要とし、ほとんどの年齢の動物に効果があります。これらのシステムはマウスにとっては簡単で便利ですが、カエルでの使用には独自の課題があります。カエルや他の両生類には耳介(外耳の構造)がありません。一部の研究者は、動物の顎、つま先、または後肢17,18にタグを取り付けている。このアプローチは、さまざまな問題を引き起こしました:顎のタグは刺激を引き起こし、興奮したカエルは前肢でタグを引き抜こうとしました17。つま先タグがつま先の間のウェビングを貫通し、動きを妨げ、紛失するリスクを運びました。そのため、両生類は識別のために独自の方法を必要とします。歴史的に、つま先切り取りは両生類17,19をマークするためにも使用されてきました。つま先は鋭利なハサミで切り取られ、動物は前足と後足のつま先の長さ、またはつま先が元に戻った角度(サンショウウオの場合)で識別できます。しかし、この方法は、つま先の切り取りが動物の動きを損なう可能性があるという倫理的な懸念を提起します17。さらに、これは出血を引き起こし、感染のリスクをもたらす可能性があります。別の確立されたマーキングシステムは、カエルの一部から皮膚を採取し、別の部分に外科的に取り付けた皮膚自家移植です。例えば、カエルの背中または肩に、その胸部20からの明るい色の皮膚移植片を使用してカエルの背中または肩をマーキングする方法が記載されている。皮膚移植には制限とリスクも伴います:この手順は侵襲的であり、Aeromonasの親水性感染、または致命的な可能性のある赤い脚のリスクをもたらします。自家移植片の完全な治癒には最大6週間かかります。そして、記載されている方法では、自家移植片20を置く場所が限られているため、6匹のカエルしか一緒に収容できません。
侵襲性の低いマーキングアプローチには、ガラスビーズとトランスポンダチップ17,19が含まれます。ガラスビーズ法では、ガラスビーズを小さな縫合糸に通し、カエルの皮膚に縫い付けます。これにより、皮膚自家移植片よりも大きな変動性が得られ、少なくとも60の特徴的な色の組み合わせがあります。しかし、縫合糸が抜けてビーズが失われるリスクがあります。あるいは、マイクロチップトランスポンダーをカエルの背側リンパ嚢の皮下に埋め込むこともできます。これは最も永続的なマーキング方法と考えられており、潜在的に無限の数の動物を個別に識別してカタログ化することができます。ただし、個々のマイクロチップは高価であり、大きなコロニーはマーキングに費用がかかるため、これは最も高価な方法でもあります。マイクロチップは、19を読み取るために特別なスキャナも必要です。Xenopusの識別のための一般的なアプローチの1つは、動物の自然な色とパターンを参照することです。これは、X. laevisのようなカエルにとって特に効果的で、彼らは成体期を通じて明確なパターンを残します。しかし、これらのパターンはストレスによって時間とともに変化する可能性があり、カエルが透明な容器と着色された容器の間を移動すると、色が異なって見えることがある15。さらに、この同定方法は、X. laevisと比較して明確なマーキングパターンが少ないX. tropicalisや、色のマーキングがないアルビノの動物にはあまり有用ではない21。明確なマーキングを持つ種であっても、研究室の担当者はマーキングの配置とサイズを異なる方法で解釈することがあり、識別にエラーが発生する可能性があります。このため、動物の撮影は、追加の識別方法と併用すると最も信頼性が高くなります。したがって、私たちは、容易に識別でき、永続的で、低侵襲の技術を使用してXenopus動物をマークし、識別することを目指しています。
両生類の入れ墨の方法を説明する公開されたリソースは限られています。入れ墨は、熱ブランド、硝酸銀ブランド、凍結ブランド17など、他のブランディング技術と一緒に説明されています。同じリソースで、入れ墨は27G皮下注射針で数字を描くことによって行われ、そのプロセスは、数字または他のマークに形作られたワイヤーを使用した他のブランディング技術とは対照的に、感染を引き起こさないことが注目されました。別の情報源では、電気入れ墨機(振動針として説明されている)がカエルに印を付けるために使用されたが、技術についての詳細はほとんど提供されなかった17,19。著者たちは、この手順がカエルの保護スライム層を乱すことで、脚が赤くなるリスクが高まると警告している。完全に非侵襲的(写真など)と恒久的な(マイクロチップなど)の両方のマーキングや識別方法はありませんが、入れ墨は効果的な妥協点を提供します。入れ墨は、皮膚自家移植などの他の技術に比べて比較的簡単です。その他の利点には、学習曲線が小さく、機器が比較的安価であることが含まれます。水生両生類の入れ墨には特定の課題が伴い、研究者を威嚇し、成功した動物のマーキングを損なう可能性があります。この論文は、回転式タトゥーマシンで大人のXenopusを入れ墨するための十分に文書化された方法を研究者に提供することを目的としています。
人間を入れ墨することは何千年も前にさかのぼる芸術形式であり、人間が自分自身を入れ墨している限り、彼らは動物にも入れ墨をしたり、ブランド化したりしてきました23。動物、特に哺乳類をマーキングするための機器と技術は、十分に確立され、十分に文書化されており、広くアクセス可能です。動物にマーキングすることは、もともと家畜と盗難の抑止力を区別す?…
The authors have nothing to disclose.
このプロトコルで使用される動物に日々の飼育を提供してくれたダートマス大学の比較医学研究センターに感謝します。また、プロトコルのテストと動物の撮影に協力してくれたリア・ジェイコブとアドワイタ・ボーズにも感謝します。最後に、タトゥーの実践に関するトレーニングを提供してくれたAnn Millerの研究室に感謝します。この研究は、NIHの助成金R00 GM147826 to J.L.の支援を受けました。
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Clip Cord | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
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Kimwipes, delicate task wipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
RCA Connection | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
Scream Ink Pitch Black, 1oz | Worldwide Tattoo Supply | SI101 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
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Styrofoam island | N/A | N/A | This is the lid of a styrofoam cold shipping container |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate) | Sigma-Aldrich | E10521 | CAUTION: IRRITANT |
Unbleached paper towels | Grainger | 2U229 | Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians |
Voltage Supply | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
Wash bottle (with frog-safe water) | Fisher Scientific | FB0340923T | Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS |
X. laevis adult female | Xenopus1 | N/A | |
Zip-top plastic bag | N/A | N/A | This bag should be large enough to hold the styrofoam island |