化学遺伝学では、標的遺伝子座においてゲートキーパー残基を異なる側鎖を含むアミノ酸に置き換えることが含まれます。ここでは、 cdpk1 の低型対立遺伝子を含む突然変異寄生虫を作製し、その突然変異体背景において寄生虫が採用する代償性経路を特定しました。
マラリア原虫による薬物の影響を覆すメカニズムの1つは、トランスクリプトームの再配線によるものです。この効果は、多重遺伝子ファミリーに属する標的遺伝子に対してより顕著です。CDPKファミリーに属する 熱帯熱マラリア原虫 プロテインキナーゼは、血液病期の発達に不可欠です。そのため、CDPKは抗マラリア化合物の開発に適したターゲットと考えられています。化学遺伝学のアプローチは、高等真核生物におけるプロテインキナーゼの機能を解明するために歴史的に使用されてきました。これには、遺伝子操作を通じてゲートキーパー残基を異なる側鎖を持つ別のアミノ酸に置き換える必要があります。ゲートキーパー位でのアミノ酸置換は、プロテインキナーゼの活性を調節し、標的遺伝子の機能的同定に役立つバンプキナーゼ阻害剤(BKI)として知られる特定のクラスの化合物に対する感受性を変化させます。ここでは、化学遺伝学のアプローチを利用して、 cdpk1の低形対立遺伝子を持つ突然変異寄生虫によって進化する代償メカニズムを理解しました。全体として、私たちのアプローチは、個々のキナーゼに対する薬剤耐性の発症を防ぐために同時に標的とされる可能性のある代償性経路を特定するのに役立ちます。
マラリアは、毎年何百万人もの死者を出している主要な感染症の1つであり、特に5歳未満の子供1人です。マラリアに対する臨床的に利用可能なワクチンはありません。さらに、ヒトで最も致命的なマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫は、アルテミシニン2,3,4,5と呼ばれる最前線の薬に対する耐性を獲得したことが知られています。アルテミシニン耐性の世界的な蔓延を避けるために、迅速に展開できる新しい薬剤標的と新しい戦略を特定することが急務です。薬物作用のメカニズムと代償経路の分子基盤をよりよく理解することは、薬剤耐性の発症を回避するためのより良い戦略を考案するのに役立ちます。
カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)ファミリーに属するプロテインキナーゼは、赤血球、性、および赤血球前期の寄生虫発生の多くの段階で重要です6。Pの無性複製中。falciparum、CDPK5は、成熟したシゾント7からのメロゾイトの出口に重要な役割を果たすことが知られています。CDPK5を条件付きで欠失させると、シゾントがメロゾイトを血流中に放出することができず、寄生虫の死につながります。CDPK5を介した寄生虫の排出の分子メカニズムは完全には理解されておらず、上流の調節因子としてプロテインキナーゼG(PKG)が関与していると考えられている7,8。CDPK7は、環状寄生虫の栄養型9への成熟に不可欠です。CDPK4は、蚊の性期の発達に重要なCDPKファミリーの別のメンバーです。それは、鞭毛化過程中の複数のステップに関与しており、したがって、遊離運動性、雄性配偶子10,11,12,13の形成に重要である。CDPK1は、内膜複合体およびロプトリの成分をリン酸化します14,15。さらに、CDPK1の条件付き欠失は、RBC16の浸潤に関与するタンパク質の低リン酸化をもたらす。CDPK1は、浸潤過程における頂端オルガネラの排出を調節することが示されています17。CDPK1は、SERA5プロテアーゼ18をリン酸化することにより、感染したRBCからのメロゾイトの排出にも役立ちます。リン酸化CDPK1は、メロゾイトの頂端に優先的に局在し、そこで侵入プロセスに必要な他の寄生虫タンパク質と相互作用する可能性がある19,20。CDPK1は、マラリアの伝播と蚊21内の寄生虫の性的発達にとって重要なステップである雄と雌の配偶子の形成にも関与しています。
化学遺伝学のアプローチは、歴史的に哺乳類のキナーゼの機能的役割の同定に使用されてきた22,23。このアプローチでは、ゲートキーパー位置の残基を異なる側鎖のアミノ酸で置換します。ゲートキーパー残基の変化は、隣接するATPポケットのサイズを調節し、その結果、バンプキナーゼ阻害剤(BKI)と呼ばれる化合物の変異酵素へのアクセシビリティが野生型と比較して変化します。ゲートキーパー位置のかさばる残基を小さな残基に置き換えると、BKIへのアクセスが可能になり、逆置換によりキナーゼはBKIに耐性を持つようになります。場合によっては、ゲートキーパー残基の置換は、標的酵素のキナーゼ活性の低下と関連しており、修飾は機能研究に耐えられないものとなる24,25。ゲートキーパー置換が酵素活性に及ぼす悪影響は、不耐性キナーゼ25の第2部位にサプレッサー変異を生じさせることで逆転させることができる。化学遺伝学のアプローチは、アピコンプレックスタンパク質キナーゼの機能を研究するために利用されています。より小さなゲートキーパー残基を含む野生型CDPK4は、バンプキナーゼ阻害剤BKI-1および1294によって選択的に阻害され、雄性配偶子形成およびオーシスト発生のブロックにつながった11,12。CDPK4の小さなゲートキーパー残基をかさばるメチオニン残基に置き換えると、鞭毛化におけるBKI媒介阻害が減少しました11。マラリア原虫と近縁のアピコンプレックス寄生虫であるトキソプラズマ原虫のCDPK1は、タキゾイトによる宿主細胞の運動性と浸潤に関与していることが示された26,27。野生型TgCDPK1の小さなゲートキーパーポケットを利用して、動物モデル28,29の疾患病因を減少させる特異的阻害剤を設計した。P.の関与。熱帯熱マラリア分裂後期の発達および配偶子形成におけるプロテインキナーゼG(PKG)は、特異的な薬理学的阻害剤を用いて酵素の活性を阻害することによって実証された30,31。ゲートキーパー位置のスレオニンをグルタミン(T618Q)に置き換えると、変異酵素の阻害剤に対する感受性が大幅に低下し、正常な配偶子形成およびシゾントからリングへの進行がもたらされた30,31。
これまでの研究のほとんどは、標的キナーゼ11,12,22,23,26,30,31の機能特性評価に化学遺伝学のアプローチを利用してきましたが、プロテインキナーゼの低型対立遺伝子を保有する寄生虫における代償メカニズムの発達を理解するために、このアプローチを採用しました。我々は以前に、CDPK1の野生型ゲートキーパー残基をメチオニン(T145M)で置換すると、変異酵素32のトランスリン酸化電位が~47%減少することを示した。cdpk1の低型対立遺伝子を含む変異寄生虫(cdpk1t145m)は、他のCDPKファミリーメンバーの転写再配線により、CDPK1の活性低下に予め適応されています。この戦略は、一般的に、必須プロテインキナーゼの低型対立遺伝子を含む変異寄生虫の代償メカニズムを解明するために利用できると考えています。標的キナーゼの機能を部分的に補償する他のキナーゼは、個々のキナーゼに対する薬剤耐性の発現を防ぐために、標的キナーゼと共に同時に阻害されてもよい。これは、マラリア対策のより良い戦略として役立つかもしれません。
cdpk1の低型対立遺伝子を含む変異型トランスジェニック寄生虫の作製は、組換え酵素を用いたin vitroキナーゼ活性データに基づいています。できるだけ多くの異なるゲートキーパー残基を持つ変異組換えタンパク質を生成する方が良いです。熱帯熱マラリア原虫のゲノムは非常にATに富んでいるため、E.大腸菌はコドンの最適化が必要?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、JNUの生命科学部の中央計装施設を通じて利用可能なサポートと施設を認めています。バイオテクノロジー省(BT/PR28256/MED/29/1313/2018)からABへの財政的支援も感謝しています。pL6eGFPおよびpUF1プラスミドを提供してくださったJose-Juan Lopez-Rubio氏に感謝します。資金提供機関は、作品の公開の準備と決定に関与していません。MSは、学術・産業研究評議会よりJRF-SRFフェローシップを授与されています。
1x phosphate inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 04906 845001 | |
AflII | NEB | R0520S | |
Albumax II | Gibco | 11021-037 | |
Anti-GST antibody | ThermoFisher Scientific | G7781 | |
Anti-Mouse HRP | Sigma-Aldrich | A4416 | |
Anti-Rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
BamHI | NEB | R3136S | |
BtgZ1 | NEB | R0703S | |
Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Sorvall legend micro 17R | |
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell) | ThermoFisher Scientific | Sorvall ST 8R | |
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite) | ThermoFisher Scientific | Sorvall ST 8R (TX-400 rotor) | |
DpnI | NEB | RO1765 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells | Sigma-Aldrich | 69956 | |
E. coli DH5a Competent Cells | Takara Bio | 9057 | |
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | BioRad | 1652086 | |
Electroporator | BioRad | GenePulser Xcell | |
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent | G-Bioscience | 7860-003 | |
Gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750078 | |
Giemsa Stain | Himedia | S011-100ML | |
Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17075601 | |
HEPES, Free Acid | Merck | 391338 | |
Hypoxanthine | Merck | 4010CBC | |
In-fusion HD cloning Kit | Takara Bio | 1711641A | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708880EDU | |
MBP, dephosphorylated | Merck | 13-110 | |
NotI | NEB | R3189S | |
Nucleobond Xtra Maxi EF | Takara Bio | 740424 | |
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit | Takara Bio | 740609 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM) | Abcam | Ab138910 | |
Primestar Max DNA Polymerase | Takara Bio | R045A | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Qiaprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200521 | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-105 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
SpeI-HF | NEB | R3133S | |
SuperScript III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080-051 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
Thiophosphate ester antibody | Abcam | Ab92570 |