ここでは、蛍光顕微鏡法を用いて、初代マウスおよびヒトT細胞におけるCa2+マイクロドメインとして知られる初期の局所Ca2+シグナルを分離するための包括的なプロトコールを提供します。このプロトコルは、免疫細胞内のCa2+シグナル伝達経路を研究し、その機能をさらに解明するための研究者にとって貴重なリソースとして機能します。
局所的なサブセカンドCa2+ シグナルは、Ca2+ マイクロドメインと呼ばれ、非常に動的で短命のCa2+ シグナルであり、その結果、全体的な[Ca2+]i 上昇を引き起こし、すでにT細胞の運命を決定している可能性があります。T細胞受容体が活性化すると、NAADPは急速に形成され、NAADP結合タンパク質(HN1L/JPT2、LSM12)およびERやリソソームなどの細胞内Ca2+ 貯蔵庫にあるそれぞれの受容体(RyR1、TPC2)に結合し、その後の[Ca2+]iの放出と上昇につながります。これらの高速で動的に発生するCa2+ シグナルを捕捉するために、Fluo-4 AMとFuraRed AMの2つのCa2+ インジケーターを組み合わせて高解像度イメージング技術を開発しました。後処理については、プログラミング言語のPythonに基づいて、オープンソースの半自動Ca2+ マイクロドメイン検出アプローチが開発されました。このワークフローを使用すると、高時間分解能および空間分解能の蛍光ビデオで、初代マウスおよびヒトT細胞の細胞内レベルでCa2+ マイクロドメインを確実に検出することができます。この方法は、NK細胞やマウス神経細胞株など、他の細胞タイプにも適用できます。
提示された蛍光顕微鏡法は、Ca2+マイクロドメインと呼ばれる初代マウスT細胞における局所的で時間的な初期カルシウム(Ca2+)シグナルの可視化を可能にします。Ca2+マイクロドメインは、非常に動的で短寿命のCa2+シグナル伝達イベントを表しており、効果的なライブセルイメージングと解析に課題を提起しています1。
T細胞は、球形と直径が6~8μmと小さいため、中心と末梢の蛍光強度が相対的に異なるため、生細胞イメージングには困難です。刺激と免疫シナプスの形成により、T細胞は形態学的変化を受け、T細胞のイメージングをさらに複雑にします1。したがって、Ca2+色素の異なる特性を表す2つの画像を記録するか、2つのCa2+色素の組み合わせを利用することによって、レシオメトリック分析を採用することが不可欠になります。Ca2+マイクロドメインの厳しい特性には、その急速性、時間的、空間的に制限された性質が含まれます。これを捕捉するために、使用するCa2+色素は、可能な限り高い時間的および空間的分解能を得るために、高い基礎輝度と高い信号対雑音比(SNR)の両方を備えている必要があります。最適な結果は、2波長色素Fura Redと単一波長色素Fluo-4の組み合わせによって達成されました。Fluo-4およびFura Redを細胞にコローディングすると、二重発光波長色素の強力な光退色と二重励起色素に関連する時間遅延によってもたらされる課題が軽減され、高速画像取得への適合性が確保されます。このアプローチにより、形状の変化や微妙な動きの視覚化がさらに容易になります。また、イメージングシステムには、チャネルの小さなクラスターの開口部から発生するCa2+信号の可視化を可能にするための空間分解能の面でも特別な要求が課せられています1。
Ca2+シグナル伝達は、シナプス形成やサイトカインの産生と放出など、T細胞内の免疫機能を活性化する上で極めて重要な役割を果たします2,3。細胞の特異的な運命は、異なる発音と局所的に分布したCa2+シグナル、Ca2+マイクロドメイン3を通じて調節される。特に、これらの局所的なCa2+シグナルは、T細胞の細胞内Ca2+レベルの広範な上昇に先行し、Ca2+マイクロドメインの形成は、Ca2+の侵入と放出の両方に依存します1,4,5。T細胞受容体(TCR)/CD3を刺激すると、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸(NAADP)、D-ミオイノシトール1,4,5-三リン酸(IP3)、環状ADPリボース(cADPR)などのCa2+放出セカンドメッセンジャーの形成が引き起こされ、細胞内Ca2+レベルが最大1 μM 6,7まで上昇します。初期のCa2+シグナル伝達イベントは、小胞体(ER)などの細胞内Ca2+貯蔵庫からのCa2+の放出に関連しており、リアノジン受容体1(RyR1)やIP3受容体(IP3R)などのチャネルがこのシグナル伝達に主に関与しています。これにより、その後、細胞外Ca2+の流入が引き起こされ、店舗で運用されるCa2+エントリー(SOCE)8を介して全体的なCa2+シグナルが生成されます。さらに、T細胞活性化9の際のCa2+シグナル伝達に関与する他のチャネル、例えば、P2X4およびP2X7チャネルはアデノシン三リン酸(ATP)依存性陽イオン流入を確保し、細胞内Ca2+の上昇に寄与しています。驚くべきことに、初期の接着依存性Ca2+マイクロドメイン(ADCM)は、TCR刺激の前にすでに形成されていますが、Ca2+の振幅と周波数は低くなっています。これらの初期のTCR非依存性Ca2+シグナルは、T細胞の炎症部位への移動に役立ち、感染部位での再刺激のためにT細胞をプライミングする可能性が最も高い10,11。
記載されているような局所的なCa2+ イメージングの方法を開発することで、T細胞活性化における初期のCa2+ シグナルの起源と意義を探るための追加のツールを得ることができました。この方法により、ユーザーは以前よりも小さく、寿命が短く、急速に発生するCa2+ シグナルを検出できます。さらに、Pythonベースの解析パイプラインであるDARTS(Deconvolution, Analysis, Registration, Tracking, and Shape normalization)により、解析ツールをより広範な利用者と共有することが可能になる12。
私たちは、抗体コーティングビーズを介したTCR/CD3刺激によってトリガーされる初代マウスおよびヒトT細胞の局所Ca2+マイクロドメインの高解像度ライブセルイメージングのための広範なプロトコルについて説明しました。さらに、ユーザーフレンドリーなオープンソースのPythonベースのアルゴリズムを実装して、ローカルのCa2+信号を識別および分析しました。特に、このプロトコルは、TCR/CD3刺激の文脈におけるCa2+マイクロドメインの検出に限定されず、NK細胞株(KHYG-1)12またはTCR非依存性のCa2+マイクロドメイン10,11などの他の(免疫)細胞タイプに適応可能である。
プロトコール内の重要なステップは、刺激ビーズのサイズと数です。免疫シナプスを模倣するには、ビーズのサイズが細胞と同程度である必要があります。したがって、初代マウスT細胞とヒトT細胞、および細胞株(JurkatおよびKHYG1)には、直径10μmの磁気ビーズを使用します。さらに、各細胞は1つのビーズによって刺激されるべきです。したがって、各スライドに追加されるビーズの数は、一方では十分であるべきですが、視野内にビーズが多すぎると背景が大きくなり、単一の活性化時間点と接触側を検出することができません。
このプロトコルは、蛍光Ca2+ 色素Fluo-4 AMおよびFuraRed AMをレシオメトリック方式で利用するため、データ13のキャリブレーションが可能です。さらに、このプロトコルは他のCa2+ インジケーターペアに適合させることができますが、Ca2+ 結合速度、細胞内分布、および光退色1の観点から、選択プロセスには注意が必要です。さらに、負荷条件は個々の細胞タイプごとに開発および最適化する必要がありますが、ここに示す濃度は適切な出発点です。Ca2+ マイクロドメインを可視化するには、Ca2+ 色素のKdが300〜1200 nMの範囲にあり、フレームあたりの取得時間が≤60 msである必要があります。蛍光強度が低すぎるとフィルターセットのチェックが必要になりますが、T細胞に2倍の量のCa2+ 色素をロードすることも可能です。しかし、Ca2+ 色素は他のオルガネラに誤って配置されたり、小胞に隔離されたりする可能性がありますが、Ca2+ バッファーとしても機能し、Ca2+ 応答に影響を与える可能性があります。
解析アルゴリズムの 1 つの制限は、セルの球形が想定されることです。したがって、形態の異なる細胞タイプには、解析ツールボックスの適応が必要になる場合があります。このアルゴリズムは、初代マウスT細胞、Jurkat T細胞、NK細胞株(KHYG-1)12の局所Ca2+マイクロドメインの解析に使用されており、マウス神経細胞株(N2a、未発表データ)のCa2+マイクロドメインの解析に成功しました。原則として、プロトコルと解析ツールボックスは、HEK293細胞やHeLa細胞などの非球状細胞タイプの解析に使用できますが、これらの細胞タイプでは、細胞の丸い構造と形状の正規化に基づいているため、ダーツボード投影を適応させることはできません。さらに、ビーズ刺激時に局在する初期Ca2+マイクロドメインを検出するプロトコルは、他の刺激、例えば可溶性活性化または阻害化合物、ならびに接着依存性およびTCR/CD3非依存性のCa2+マイクロドメイン10,11に由来する局所Ca2+シグナルを分析するために適合させることができる。注目すべきは、可溶性化合物の活性化開始点を決定するよりも、時間と位置の観点から単一のビーズ接触を定義する方が容易であることです。
Ca2+マイクロドメイン形成の検出における一般的な制限は、必要な高い時間空間分解能と必要な高い信号対雑音比(SNR)にあります。現在、私たちのセットアップから導き出された解像度は、計算された空間解像度~0.368μm、時間分解能~40フレーム/秒(fps)1に達しています。近年のカメラや検出器の開発の進歩、蛍光色素の改良により、将来的には、より高い時間分解能と空間分解能を持つCa2+インジケーターを用いた生細胞イメージングのためのORAI-GECI(genetically expressed Ca2+ indicators)コンストラクト24に記載されているように、光学的シングルチャネル記録に到達する可能性がある。
まとめると、ここで説明する高分解能Ca2+ マイクロドメインイメージングのプロトコルと解析ツールは、T細胞の初期局所Ca2+ シグナルの解析だけでなく、他の細胞タイプにも適応させて、T細胞の局所Ca2+ シグナル伝達の重要性を解読することができます。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、ドイツ研究振興協会(DFG)(プロジェクト番号335447717;SFB1328、A02からB-PDおよびRW。A14からET;プロジェクト番号516286863 B-PDへ)。著者らは、献血者とUKEの輸血医学部門の協力に感謝します。
α-CD3 | BD Pharmingen | 553058 | |
α-CD28 | BD Pharmingen | 553295 | |
Anaconda | Anaconda | https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Cell strainer | Biofil | CSS-013-070 | 70 µm diameter |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | A49865 | |
Cover slips | Paul Marienfeld GmbH | 101202 | |
DARTS | GitHub | https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS | |
Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco, Thermo Fisher | 14190144 | |
EasySep CD4+ T cell Isolation Kit | Stemcell | 19852 | |
EasySep Magnetic Multistand | Stemcell | 18010 | |
Fluo 4-AM | Invitrogen | F14201 | |
Fura Red-AM | Invitrogen | F3020 | |
Gibco RPMI 1640 medium | Gibco, Thermo Fisher | 11875093 | |
Git | GitHub | https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git | |
immersion oil | Leica | 11513859 | |
Newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4637 | |
Oracle | Oracle | https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/ | |
Penicillin/Streptamycin | Gibco, Thermo Fisher | 15240062 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Protein G magnetic beads | Merck | LSKMAGG02 | 10 µM diameter |
Python | Python | https://www.python.org/downloads/ | |
Silicon grease (basylone) | Bayer | 291-1220 | |
Time-Dependent Entropy Deconvolution | GitHub | https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters | |
Tween | q-biogene | TWEEN201 |