高速液体クロマトグラフィーを用いたマウス眼組織および非眼組織における食事性ビタミンA代謝物の定量分析

Gタンパク質共役受容体(GPCR)は、知られているタンパク質の中で最も研究され、特徴付けられたタンパク質のスーパーファミリーの1つです。GPCRは、シグナル伝達における細胞表面受容体として働き、特定のリガンドと結合すると細胞内応答を初期化する機能として最もよく知られています。GPCRは、7つの膜貫通型(TM)ヘリカルドメインと6つのトータルループドメインによって特徴付けられます。6つのループのうち、3つのループはリガンドの結合を促進するために細胞外に配向されており、他の3つの細胞内ループは、Gα、Gβ、およびGγサブユニット^からなるヘテロ三量体Gタンパク質に結合しています^1,2。

GPCRは、クラスAロドプシン様、クラスBセクレチン受容体ファミリー、クラスCグルタミン酸、クラスD真菌交配フェロモン受容体、クラスEサイクリックAMP受容体、クラスFフリズル/スムージング^3,4など、いくつかのクラスに分類されます。GPCRのロドプシン様クラスAサブクラスには、光伝達と視覚機能を担う重要なGPCRであるロドプシンが含まれています。ロドプシンには、前述の7つのTMヘリックスドメイン、6つの細胞外および細胞内ループ、光受容体^1,5,6,7のトランスデューシン(G_t)としても知られるヘテロ三量体Gタンパク質との関連など、GPCRの標準モデルに見られるすべての関連する主要な特性と構造要素が含まれています。ロドプシンの結合ポケット内では、光感受性発色団リガンドである11-シス-レチナールが、共有結合シッフ塩基結合を介してリジン296上のロドプシンに結合し、11-シス-レチニリデン^1,8を形成します。光子を吸収すると、11-シス-レチニリデンは光異性体化して全-トランス-レチニリデンになり、ロドプシン内で立体配座変化を誘発します。したがって、11-cis-レチナールリガンドはロドプシンGPCRの機能にとって重要であり、光受容体内の高い代謝回転率を克服するためには、11-cis-レチナールの堅牢で効率的な供給を継続的に維持する必要があります。

11-cis-レチナールなどのレチナールデヒドは、まとめてレチノイドと呼ばれる分子のグループに属し、生物学的に関連性のあるレチノイドは、より広くビタミンAと呼ばれています。レチナルデヒドおよびビタミンAの関連ビタマーもこの特性評価に例外ではなく、環状末端基としてのβ-イオノン環、ジテルペンポリエン鎖、およびビタマーに応じて異なる極性末端基、すなわち、レチナールデヒドのアルデヒド基、レチノールのヒドロキシル基、レチノイン酸のカルボキシル基、レチニルエステルのエステル結合、 など(図1)^9,10。

哺乳類はビタミンAを新規に合成することはできませんが、植物は合成できます。したがって、哺乳類のシステム内のすべてのレチノイドは、植物ベースの生産者の食事から食物連鎖の消費者に由来する必要があります。ビタミンA代謝の標準的なモデルでは、植物の原型であるβ-カロチンは、植物の原型であるプロビタミンAがスカベンジャー受容体クラスBのメンバー1(SCARB1)を介して腸腸細胞に吸収され、β-カロテンオキシゲナーゼ1(BCO1/BCMO1)によって2分子のオールトランスレチナールに切断され、レチナールデヒド結合タンパク質2(RBP2)に結合してオールトランスに還元されます-レチノールデヒドロゲナーゼ(RDH)によるレチノールは、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ(LRAT)によってレチニルエステルに変換され、その後、カイロミクロン11,12,13,14で血流に送られます。一方、パルミチン酸レチニルなどのレチニルエステルは、動物由来の主要なプロビタミンAとして機能します。腸管腔からのパルミチン酸レチニルは、カルボキシルエステラーゼ1(CES1)によって全トランスレチノールに加水分解され、腸腸細胞¹⁵に拡散します。肝臓は、ビタミンA恒常性のための主要な貯蔵および恒常性器官であり、これらのカイロミクロン内のレチニルエステルを吸収し、レチニルエステル加水分解酵素によって細胞性レチノール結合タンパク質1(CRBP1)に結合した全トランスレチノールに加水分解され、肝臓の星状細胞に入り、貯蔵のためのLRATによってレチニルエステルに戻されます^13,16、17.生体内のビタミンAの恒常性を維持するために、肝臓は、レチノール結合タンパク質4(RBP4)とトランスサイレチン(TTR)からなる血清輸送複合体に結合した全トランスレチノールの形でビタミンAを放出します15,18,19。この複合体は、この原稿ではholo-RBP4と呼ばれます。

この全身性ビタミンAの血液供給を利用するためには、ビタミンAの強固な供給源が維持されている眼組織を含む全身組織に、ホロRBP4を組織に吸収する方法が必要です。眼組織の視細胞に富む網膜内では、レチノイン酸6(STRA6)によって刺激される膜受容体がこの機能に関与するトランスポーターです。機構研究では、STRA6 は、holo-RBP4 から RPE²⁰ への細胞外全トランスレチノールの摂取を促進することができることが示されています。この輸入された全トランスレチノールは、その後、全トランスレチノールがRPEおよび光受容体の外側セグメント内で11-シスレチナールに変換されるプロセスである視覚周期に入り、それによってロドプシン^9,21に結合したときに視覚機能を促進します。

循環性ホロRBP4由来の全トランスレチノールが血液網膜関門を通過してSTRA6を介して眼組織内のRPEに入ると、RPE中の全トランスレチノールはまずLRATによってレチニルエステルにエステル化され、次に網膜色素上皮特異的65 kDaタンパク質(RPE65)によって11-シス-レチノールに加水分解されます。その後、11-CIS-レチノールは、レチノールデヒドロゲナーゼ5によって11-CIS-レチナールに変換されます。次いで、この11-cis-レチナールは、光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP^)9,21によって光受容体の外側セグメント(OS)に運ばれる。外核層(ONL)内の視細胞核を囲む小胞体内では、オプシンGPCRが合成され、接続繊毛(CC)を介して輸送されます。CCを横切るこの輸送に関与するモータータンパク質は論争の的となっているが、現在の仮説では、キネシンおよびダイニンベースの鞭毛内輸送(IFT)またはミオシンベースの輸送がこのプロセスの促進因子である可能性が高いとされている14,22,23,24,25,26。これら2つの成分がOS内の膜状円板内で出会うと、11-シス-レチナールとオプシンは、ロドプシン上のリジン196のシッフ塩基共有結合を介して11-シス-レチニリデンを形成し、光伝達の準備が整^{います8。}

網膜のRPE内でのSTRA6の発現は、holo-RBP4からのオールトランスレチノールの摂取を促進するのに役立ちますが、STRA6は、ビタミンAの主要な恒常性器官としての役割とholo-RBP4からのオールトランスレチノールの摂取能力を示すにもかかわらず、肝臓で発現されることは見つかりませんでした15,19,27,28^{、29、30、31}。最終的に、レチノール結合タンパク質4受容体2(RBPR2)と呼ばれる類似の受容体が発見され、STRA6と同様にホロRBP4から全トランスレチノールを摂取する能力を示すが、肝臓組織で発現する³²。

したがって、視覚機能におけるロドプシンの役割を完全に理解するには、視覚色素の再生に至る生物学的プロセスを理解する必要があります。これは、プロビタミンA前駆体の代謝、肝臓内での貯蔵、肝臓によるホロRBP4の放出、STRA6およびRBPR2膜受容体を介したホロRBP4の最終的な取り込みなど、前述のプロセスと密接に関連しています。前述のように、マウスなどの動物モデルは、そのようなプロセスの研究における主要なモデルの1つであり続けています。そこで、マウス組織中のレチノイドの抽出法と、これらのレチノイドを検出・定量できる順相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法について紹介したい。これらの方法を使用すると、11-cis-レチナールロドプシンリガンドやメイントランスポートレチノイドのall-trans–レチノールなど、上述の重要なレチノイドを眼、肝臓、および全身の臓器で分析できます。マウス組織におけるレチノイドの供給を評価することにより、レチノイドの物流供給に関連する病状と病状の理解をさらに進めることができます。

レチノイドは、オプシンGPCRとの関連を通じて視覚機能における発色団として機能するだけでなく、レチノイン酸シグナル伝達を通じて哺乳類細胞のシグナル伝達においても主要な役割を果たしており、これは、DNAに直接結合し、遺伝子転写を制御するレチノイン酸受容体(RAR)とレチノイドX受容体(RXR)の2つのファミリーによって促進されます³³.これら2つのファミリーまたは受容体はどちらも、リガンドとしてレチノイン酸の形でレチノイドを利用します。RARは、オールトランスレチノイン酸と9-シス-レチノイン酸の両方に対して親和性を有することが示されていますが、RXRは9-シス-レチノイン酸に対してのみ親和性を示します^34,35。制御されていない量のレチノイン酸は催奇形性であり、レチノイン酸シグナル伝達は極めて厳密に制御されなければならない³⁶。シグナル伝達のためのレチノイン酸の産生は、後脳や四肢の発達など、組織の適切な発達のために局所的かつ非常に特定の時点で行われなければならないが、他の無数の例がレチノイン酸シグナル伝達を利用している^37,38。レチノイン酸シグナル伝達に関与する細胞内では、レチノイン酸は、STRA6またはRBPR2によって取り込まれたレチノールのレチノイルデヒドへの酸化を促進するアルコール/レチノールデヒドロゲナーゼ(ADH/RDH)と、レチノアルデヒドのレチノイン酸への酸化を促進するレチナールデヒドデヒドロゲナーゼ(RALDH)の2つの酵素群によって合成される³⁹。それ自体はGPCRシグナル伝達に関与していませんが、それでもレチノイン酸は、シグナル伝達受容体のリガンドとしても機能する重要なレチノイドとして存在します。

ここでは詳しく説明しませんが、食品研究や微生物ロドプシンの研究など、さまざまな状況でHPLCを使用したレチノイド検出の以前に確立された方法に感謝したいと思います。これらの方法は、揮発性および危険性の低い移動相40,41,42を必要とする逆相技術の使用、レチノイン酸およびそれらに関連する異性体^40,41の検出、および異なる生物学的源からの精製および抽出⁴³を含む、レチノイド検出に対する異なる目標とアプローチを採用する.私たちの方法は、特に哺乳類組織からのパルミチン酸レチニル、レチナールデヒド異性体、およびレチノール異性体の検出に焦点を当てています。意図したユースケースがこの特定のアプリケーションと異なる場合は、異なるプロトコルを考慮する必要があります。