ここでは、高出力の375 nmおよび405 nmレーザーがHoechst 33342を効果的に励起し、サイドポピュレーション(SP)細胞検出用の355 nmレーザーの実行可能な代替品として機能することを示し、それによりフローサイトメトリーアプリケーションで利用可能なレーザーの範囲が広がります。
サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。Hoechst SP法は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターの色素排出特性に基づく幹細胞の単離に利用されています。この方法は当初、造血幹細胞(HSC)の同定と単離に採用されましたが、現在では主にがん幹細胞(CSC)の同定と単離に焦点を当てるように進化しています。FCMの従来の検出法では、355 nmレーザーを使用して色素を励起し、SP細胞を検出します。この研究を通じて、355 nmレーザーを使用したSP細胞の検出を効果的に置き換えることができる色素励起の代替アプローチを特定することに成功しました。これは、高出力の375nmまたは405nmレーザーを利用することで実現されます。これにより、355 nmレーザーフローサイトメトリーのみに限定されるのではなく、SP細胞の検出において選択性を高めることができます。
サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。SP細胞は、それらのATP結合カセット(ABC)トランスポーター1,2を介して、蛍光DNA色素を細胞からポンピングすることを特徴としている。この方法はもともと、マウスの骨髄造血幹細胞(HSC)を単離するために確立されました1。骨髄SP細胞は、CD117+Sca-1+Lin-Thy1低発現3,4を特徴とするHSCの集団で濃縮されました。その後、この方法は、心筋5、肝臓6、肺7、腎臓8、および前脳9などの他の組織から幹細胞を単離し、濃縮するために広く使用されました。特に、この方法は過去10年間でがん幹細胞(CSC)の単離に適用されてきました。CSCは、腫瘍の開始、自己再生、化学療法に対する耐性、および転移性の特性を持つ細胞の小さな集団を表しています10。CSCは、最初に造血悪性腫瘍11で同定され、その後、前立腺12、卵巣13、胃14、乳房15、および肺16癌などのさまざまな固形腫瘍で観察されました。CSCの同定にはさまざまな技術がありますが、SP技術は、多様な組織や細胞株に幅広く適用できるため、依然として好まれる選択肢です。さらに、これは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)16,17,18を用いてCSCを単離する貴重な技術である。実験結果は、SP細胞が顕著な腫瘍原性を示し、幹細胞関連遺伝子の発現レベルが高いことを示しています19,20。私たちの以前の研究21では、多発性骨髄腫で単離されたSP細胞のトランスクリプトーム分析により、ヘッジホッグ経路などの幹細胞に関連するシグナル伝達経路の濃縮が明らかになることも示されました。一方、急性骨髄性白血病のSP細胞で差次的に発現する遺伝子のパスウェイエンリッチメント解析を行った22。改変された遺伝子は、幹細胞関連経路(Wnt/β-カテニン、TGF-β、ヘッジホッグ、ノッチ)に富んでいました。その結果、BALB/c欠損マウス22では1×105 SP細胞が腫瘍を形成できるのに対し、非SP細胞は腫瘍を形成できないことがわかったことから、SP細胞は白血病幹細胞の特徴を持っていることが示された。CSCの同定におけるHoechst SP法の有効性は明らかです。
Hoechst SPのプロトコールは、研究の進展を通じて洗練され、強化されてきました。このプロトコルでは、色素濃度、細胞密度、インキュベーション温度とインキュベーション時間、緩衝液組成、およびpH値を厳密に制御する必要があります。このプロトコルに従って調製した細胞サンプルをフローサイトメトリー分析に供した。355 nmのUVレーザーによるHoechst色素の励起と、690/50 nmフィルター(Hoechst Red)と450/50 nmフィルター(Hoechst Blue)の両方を使用してその蛍光発光を検出するため、FCMには350 nmレーザーが必要です。ただし、350 nmレーザーはコストが高いため、ほとんどのFCMには一般的に装備されていません。したがって、フローサイトメトリーによるSP細胞の効果的な検出のための色素励起の代替アプローチを見つけることを試みました。この研究では、375 nmおよび405 nmレーザーのSP細胞検出能力を評価し、355 nmレーザーの能力と比較しました。私たちの発見は、355 nm、375 nm、および405 nmのレーザーによって検出されたSP細胞間の顕著な類似性を示しています。これらの結果は、高出力の375nmおよび405nmレーザーが、SP細胞検出のための355nmレーザーの実行可能な代替手段として役立つことを示唆しています。Hoechst 33342 には励起光源を追加することで、より多くのフローサイトメトリーモデルの使用が容易になります。
記載されているプロトコルを使用して3つの実験を行い、各試験には3〜4匹のマウスを使用し、合計10匹のマウスを作成しました。SP細胞の割合は0.05%から0.76%の範囲であった。マウス間で個々の変動が観察されたことに注意することが重要です。4つのフローサイトメーターを使用して、Hoechstサンプルを分析しました。新しいバージョンのフローサイトメトリーでの20 mW 355 nmレーザーによるHoechs…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、中国国家自然科学基金会(No.81800207)からJ.H.への助成金によって支援されました。Beckman Coulter, Inc.のフローサイトメトリーとパラメータキャリブレーションのサポートにご協力いただき、大変感謝しています。フローサイトメトリーデータ取得にご協力いただいた四川大学西中国口腔病病院口腔疾患国家重点研究所のJiao Chen氏と、四川大学華西病院再生医療研究センターのYu Qi氏に感謝いたします。
Automatic cell counter | Countstar | 1M1200 | |
Cell Filter(100 µm) | BIOFIL | CSS-013-100 | |
Daily quality control fluorospheres | Beckman Coulter | B5230 | |
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium) | CORNING | 10-013-CVRC | |
Fetal bovine serum | CORNING | 35-081-CV | |
HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |