Immunodosaggio fluorescente a flusso laterale basato su nanosfere di punti quantici
概要
Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di nanosfere a punti quantici (QDNB) e il rilevamento di biomarcatori di malattia utilizzando strisce di immunodosaggio a flusso laterale basate su QDNB. I risultati del test possono essere valutati qualitativamente sotto l’illuminazione a luce UV e misurati quantitativamente utilizzando un lettore di strisce fluorescenti entro 15 minuti.
Abstract
I punti quantici, noti anche come nanocristalli semiconduttori, sono nuove etichette fluorescenti per l’imaging e il rilevamento biologico. Tuttavia, i coniugati punto-anticorpo quantici di piccole dimensioni (~10 nm), preparati attraverso laboriose procedure di purificazione, mostrano una sensibilità limitata nel rilevare alcuni marcatori di malattia in tracce utilizzando strisce di immunodosaggio a flusso laterale. In questo articolo, presentiamo un metodo per la preparazione di nanosfere di punti quantici (QDNB) utilizzando un metodo di evaporazione dell’emulsione in un’unica fase. Utilizzando il QDNB così preparato, è stato fabbricato un test immunologico a flusso laterale fluorescente per rilevare i biomarcatori della malattia utilizzando come esempio la proteina C-reattiva (CRP). A differenza delle nanoparticelle a singolo punto quantico, i coniugati nanobead-anticorpo a punto quantico sono più sensibili come etichette di immunodosaggio a causa dell’amplificazione del segnale incapsulando centinaia di punti quantici in una nanosfera composita polimerica. Inoltre, le dimensioni maggiori dei QDNB facilitano la separazione per centrifugazione quando si coniugano i QDNB con gli anticorpi. Il test immunologico a flusso laterale fluorescente basato sui QDNB è stato fabbricato e la concentrazione di CRP nel campione è stata misurata in 15 minuti. I risultati del test possono essere valutati qualitativamente sotto l’illuminazione a luce UV e misurati quantitativamente utilizzando un lettore fluorescente entro 15 minuti.
Introduction
Le strisce per immunodosaggio a flusso laterale (LFIA) fungono da strumenti cruciali per il rilevamento rapido presso il punto di cura 1,2, in particolare nello screening delle malattie durante le epidemie. Tuttavia, le tradizionali strisce reattive LFIA a base di oro colloidale mostrano una bassa sensibilità di rilevamento e forniscono solo risultati qualitativi3. Per migliorare la sensibilità di rilevamento di LFIA, sono emerse varie nuove nanoparticelle, tra cui il lattice colorato 4,5, le nanoparticelle fluorescentidi conversione 6, le microsfere fluorescenti risolte nel tempo 7,8 e i punti quantici 9,10,11. I punti quantici (QD)12,13, noti anche come nanocristalli semiconduttori, offrono lunghezze d’onda di emissione regolabili, un’ampia gamma di eccitazione e un’elevata efficienza di luminescenza, rendendoli etichette ideali per l’imaging biologico.
Tuttavia, il segnale di fluorescenza emesso dai singoli punti quantici rimane debole, con conseguente sensibilità di rilevamento relativamente bassa nei saggi immunologici. L’incapsulamento di numerosi punti quantici all’interno di microsfere può amplificare i segnali e migliorare la sensibilità dei saggi immunologici basati su punti quantici. Vari metodi, come l’autoassemblaggio strato per strato 14,15,16,17,18, il metodo di rigonfiamento19,20 e l’incapsulamento con microsfere di silice 21,22,23,24, sono stati impiegati per incapsulare i punti quantici all’interno delle microsfere. Ad esempio, le etichette di nanosfere di silice funzionalizzate con punti quantici possono essere ottenute aumentando il carico QD per immunoreazione a sandwich25. Un essiccatore a spruzzo dotato di un atomizzatore a ultrasuoni è stato utilizzato anche per preparare nanosfere QD-BSA26 su scala nanometrica. Tuttavia, i metodi sopra menzionati soffrono di complesse fasi multiple, estinzione della fluorescenza e bassa produttività.
Nel nostro precedente lavoro27, è stato riportato un metodo di evaporazione emulsione-solvente per incapsulare punti quantici all’interno di nanosfere polimeriche. Questa tecnica di preparazione è semplice, mantiene l’efficienza fluorescente dei QD, garantisce un’elevata efficienza di incapsulamento e consente una produzione facilmente scalabile. Diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato con successo strisce LFIA utilizzando QDNB preparati con questo metodo per applicazioni, tra cui il rilevamento di tossine alimentari 28,29,30, il rilevamento di biomarcatori di malattie infettive 31,32 e il monitoraggio ambientale33.
Questo protocollo presenta fasi di preparazione specifiche per le nanosfere di punti quantici (QDNB), la coniugazione di QDNB e anticorpi, la preparazione di LFIA basata su QDNB e la misurazione della proteina C-reattiva (CRP) in campioni di plasma umano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di nanosfere a punti quantici (QDNB)27 e l’uso di QDNB per la preparazione di saggi immunologici a flusso laterale fluorescenti (LFIA). Viene dimostrata la misurazione qualitativa e quantitativa della CRP nei campioni. Questo LFIA basato su QDNB può essere applicato anche ad altri biomarcatori di malattie 25,32, tossine alimentari29,30<…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Progetto del Comitato per la Scienza e la Tecnologia di Shanghai (STCSM) (22S31902000) e dal Programma di incubazione della ricerca clinica dell’Ospedale per le malattie della pelle di Shanghai (NO. lcfy2021-10).
Materials
| (dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03450 | |
| Absorbance paper | Kinbio Biotech | CH37K | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| CdSe/ZnS quantum dot | Suzhou Mesolight Inc. | CdSe/ZnS-625 | |
| Choloroform | Sino Pharm | 10006818 | |
| CRP antibody | Hytest Biotech | 4C28 | |
| Fluorescent lateral flow assay reader | Suzhou Helmence Precision Instrument | FIC-H1 | |
| Glass fiber pad | Kinbio Biotech | SB06 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D111018 | |
| Nitrocellulose membrane | Satorious | CN140 | |
| Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer | Sigma-Aldrich | S458066 | |
| Rabbit IgG | Sangon Biotech | D110502 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sino Pharm | 30166428 | |
| Sodium hydroxide | Sino Pharm | 10019718 |
参考文献
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