概要

経上皮電気インピーダンスモニタリングによる多孔質基板ベースのエレクトロポレーション

Published: September 27, 2024
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概要

多孔質基質エレクトロポレーション(PSEP)は、一貫したハイスループットデリバリーと高い細胞生存率を兼ね備えています。経上皮電気インピーダンス(TEEI)測定の導入により、PSEPの中間プロセスに関する洞察が得られ、ラベルフリーの送達が可能になります。この記事では、PSEP送達実験とTEEI測定解析を同時に行う方法について説明します。

Abstract

多孔質基板エレクトロポレーション(PSEP)は、高スループットと一貫した送達を提供する新しいエレクトロポレーション方法です。他の多くの種類の細胞内送達と同様に、PSEPは、送達の成功を判断するために蛍光マーカーと蛍光顕微鏡法に大きく依存しています。エレクトロポレーションプロセスの中間ステップに関する洞察を得るために、経上皮電気インピーダンス(TEEI)モニタリングを統合したPSEPプラットフォームが開発されました。細胞は、多孔質膜を備えた市販のインサートで培養されます。完全にコンフルエントな細胞単層の形成を可能にするための12時間のインキュベーション期間の後、インサートをPSEPデバイスのウェルにあるトランスフェクション培地に入れます。次に、細胞単層をユーザー定義の波形にさらし、蛍光顕微鏡で送達効率を確認します。このワークフローは、PSEPプロセスに関する追加データを収集するために、パルス顕微鏡と蛍光顕微鏡の間のTEEI測定によって大幅に強化でき、この追加のTEEIデータは、送達効率や生存率などの送達指標と相関しています。この記事では、TEEI測定でPSEPを実行するためのプロトコルについて説明します。

Introduction

エレクトロポレーションは、細胞を電場にさらす技術で、細胞膜に一時的な孔を作り、タンパク質、RNA、DNAなどのカーゴが通過できるようにします1,2。最も広く使用されているのは、バルクエレクトロポレーション(BEP)です。BEPは、数百万個の細胞を含む電解質をキュベットに充填し、電解質を高電圧にさらし、拡散またはエンドサイトーシスを通じて貨物を細胞内に侵入させることによって実行されます1。BEPには、ハイスループットや多数の市販システムなど、多くの利点があります。ただし、BEP 配信には制限があります。電極に対する細胞の位置に一貫性がなく、隣接する細胞からの電界遮蔽により、BEP 3,4中の電界ばく露に大きなばらつきが生じます。BEPに必要な高電圧は、細胞の生存率にも大きな悪影響を及ぼします5。2011年6月の開始以来、多孔質基質エレクトロポレーション(PSEP)と呼ばれるエレクトロポレーション法への関心が高まっているが、局在エレクトロポレーションやナノまたはマイクロエレクトロポレーション1,7,8などの他の名前で呼ばれることもある。BEPの細胞懸濁液とは対照的に、PSEPは多孔質基質に接着した細胞上で行われます。接着状態は、大多数のヒト細胞株9にとって好ましいだけでなく、基質の細孔も電流に焦点を合わせ、膜貫通電位(TMP)を細胞膜の特定の領域に局在させる10,11。この局在化により、印加電圧の大幅な低減が可能になり、損傷が減少し、細胞の生存率が向上します。この効果の組み合わせは、細胞膜の細孔形成を制御するのに役立ち、その結果、より一貫性のある効率的な送達が実現します1,5,12

最近の研究では、市販の多孔質膜インサート13 (図1A、B)を保持するための6ウェルの金メッキ電極アレイを備えたPSEPデバイスが導入されました。これは、Vindisらによって最初に導入された方法です14。このデバイスは、パルスを印加し、経上皮電気インピーダンス(TEEI)として知られる細胞単層全体の電気インピーダンスをリアルタイムで測定できます13。デバイスのユーザーインターフェースにより、エレクトロポレーション波形と極性を完全に制御できます。重要なのは、リアルタイムのインピーダンス測定を使用して、高価な試薬や蛍光マーカーを必要とせずに送達結果を予測できることです。これはラベルフリー送達15として知られています。

PSEPプラットフォームは、パルス発生器とTEEI測定装置を収容するデバイスの本体と、多孔質基板が挿入され、エレクトロポレーションが発生する電極アレイの2つの主要なカスタム電気部品で構成されています。すべてのカスタム電子機器と3Dプリントコンポーネントの図は、GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI にあります。カスタム電子機器に加えて、プラットフォームが正しく機能するためにはコンピューターも必要です。このカスタムソフトウェアを実行するには MATLAB (バージョン 2021a 以降) が必要であり、解析用のデータを保存してアクセスするには Microsoft Excel が必要です。このプログラムは、カスタム電子機器を制御し、設定を調整するためのグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)を提供します。これらのプログラムは、GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI でも公開されています。

予備データでは、このプロセスはさまざまなタイプの接着細胞で可能であることが示唆されていますが(図1C)、この記事では、Brooksらがこの細胞株に最適であると判断したパラメータを使用したA431細胞の調製についてのみ説明します13。さらに、ヨウ化プロピジウム(PI)カーゴは細胞毒性があるため、2つの実験が行われ、1つ目は高濃度のPIトランスフェクション培地を使用して送達効率を定量化し、もう1つは細胞培養培地のみを使用してより長い時間スケールでTEEIを測定します。これらの実験では、同一のエレクトロポレーション波形を使用しているため、結果を相関させることができます(図1D)。

Figure 1
図1:電極アレイの組み立て図と基本データ(A)電極アレイのウェル内のインサートのCADモデル。(B)電極アレイのCADモデル。(C)選択した細胞株のPSEPによるインピーダンスの増加、細胞株あたりn = 3。エラーバー:平均の標準誤差。(D)配送効率TEEI は相関データを増やします。送達効率は、送達実験からPI画像とカルセイン画像の両方で標識された細胞の数を、Hoechstで同定された細胞の総数で割ることによって計算されました。セル数は、カスタム CellProfiler パイプライン (電圧あたり n = 6) を使用して決定しました。エラーバー:(x軸とy軸)平均の標準誤差。この図は、Brooks et al.13から許可を得て転載しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。 1. 試薬の調製と細胞培養 50 mLのウシ胎児血清(FBS)と5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンをDulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)の500 mL容器に加えて、細胞培養培地を調製します。汚染のリスクを減らすために11個の50 mLアリコートを製造し、4°Cで?…

Representative Results

与えられたプロトコルは、TEEI測定を使用してエレクトロポレーションの中間プロセスを調べ、特にA431細胞株とPIカーゴについて送達予測を行う方法を確立します。このプロトコルの変更については、この記事で詳しく説明しますが、特定の値は変わる可能性がありますが、応答の一般的な傾向は一貫していることに注意することが重要です。例えば、初期ベースラ?…

Discussion

図2C は、TEEIが最小値から増加し、ベースラインから減少する様子を各PSEP波形電圧についてプロットすることを示しています。TEEIの増加は放物線弧を作成し、減少する前に約20ボルトでピークに達しますが、ベースラインからのTEEIの減少は電圧が増加するにつれて指数関数的に増加します。 図 2D の供給効率とデス パーセ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NSF(Awards 1826135、1936065、2143997)、NIH国立総合医科学研究所P20GM113126(Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication)、P30GM127200(Nebraska Center for Nanomedicine)、Nebraska Collaborative Initiative、Voelte-Keegan Bioengineering Supportからの資金援助に感謝します。このデバイスは、Nebraska Research Initiativeが一部出資しているNanoEngineering Research Core Facility(NERCF)で製造されました。

Materials

15 mL Conical Centrifuge Tube Thermo Scientific 339651
2-Chip Disposable Hemocytometer Bulldog Bio DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask fisherbrand FB012937
A431 Cells ATCC CRL-1555
Calcein AM Invitrogen C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet Labgard NU-543-600
Custom Components YangLab https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) fisherbrand 05-539-6
DMEM Gibco 11965092
Fetal Bovine Serum Gibco A5670401
Fluid Aspiration System vacuubrand 20727403
HERACELL 240i Thermo Scientific 51026331
Hoechst 33342 Thermo Scientific 62249
Human Plasma Fibronectin Sigma-Aldrich FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope Zeiss 491916-0001-000
Inverted Microscope Labomed TCM 400
PBS cytiva SH30256.02
PCR Tube 200 µL Sarstedt 72.737
Penicillin / Streptomycin Gibco 15140148
Pipette (0.2-2 µL) fisherbrand Elite FBE00002
Pipette (100-1000 µL) fisherbrand Elite FBE01000
Pipette (20-200 µL) fisherbrand Elite FBE00200
Pipette (2-20 µL) fisherbrand Elite FBE00020
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL Sarstedt 72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004240
Thincert (24-well) Greiner Bio-One 662 641 0.4 µm pore diameter, 2×106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well) fisherbrand FB012929
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154-20mL
Trypsin Gibco 15090046

参考文献

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記事を引用
Lorenzen, S. R., Brooks, J. R., Heiman, T. C., Yang, R. Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring. J. Vis. Exp. (211), e66971, doi:10.3791/66971 (2024).

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