זיהוי מונחה ביואסי של מוצרים טבעיים להדברה ביולוגית על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה - ביואוטוגרפיה ישירה

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. 1. בחירת המועמדים להדברה ביולוגית מיקרוביאלית באמצעות מבחני לוחיות תחרות, בחר מבודדים מיקרוביאליים המפגינים אנטגוניזם נגד הפתוגן המעניין.הערה: נבחרו תשעה מבודדי Bacillus שהפגינו אנטגוניזם נגד S. sclerotiorum, כולל המינים Bacillus atrophaeus, mojavensis ו-subtilis, כדי להדגים פרוטוקול זה. 2. הכנת מדיה הכינו אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) על ידי המסת 39 גרם של מדיום לליטר מים. הכינו Pseudomonas F אגר על ידי הוספת 45 גרם של מדיה לכל ליטר מים. הכינו ציר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDB) עם 1% אגר על ידי הוספת 24 גרם בינוני, ו 0.24 גרם אגר לליטר מים. הכינו ציר שמרים-גלוקוז-מנגן (YGM). צור תמיסת חיץ המורכבת מ- 2.5 גרם של KH2PO4 ו- 2.5 גרם K2HPO4 ב- 100 מ”ל מים, ותמיסת מלח המורכבת מ- 0.58 גרם של MnSO4. H20, 0.5 גרם של NaCl ו 0.05 גרם של FeSO 4.7H20 ב 100 מ”ל של מים.לאחר מכן, להוסיף 1 גרם של תמצית שמרים, 1.25 גרם של דקסטרוז, 400 מ”ל של מים, 5 מ”ל של תמיסת חיץ, 5 מ”ל של תמיסת מלח ו 90 מ”ל של מים כדי להבטיח כי מלחי מתכת לא לזרז בתמיסה. לעקר את המדיה, לשפוך את האגר לתוך לוחות פטרי 100 x 15 מ”מ, ולתת לכולם להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש. 3. הכנת פתוגן תרכבו חמש צלחות של Sclerotinia sclerotiorum על מחשב כף יד (מוכן בשלב 2.1) ודגרו ב 25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. 4. הכנת תמצית מוצר טבעית תרבית כל חיידק מבודד על Pseudomonas F אגר (מוכן בשלב 2.2) וגדל עד מושבות בודדות נצפים. תת-תרבית מושבות חיידקים בודדות לתוך 25 מ”ל של מדיה YGM בצנטריפוגות או צינורות תרבית ולדגור עם רעד במשך 3 ימים. מעבירים 5 מ”ל של aliquots של כל תמצית לתוך 1 L של YGM ולדגור באותם תנאים במשך 3 ימים נוספים. צנטריפוגה כל תרבית ב 3000 x גרם במשך 15 דקות ב 25 ° C כדי pellet את התאים. דקקו ושטפו את הסופרנאטנט שלוש פעמים עם אתיל אצטט כדי לחלץ מטבוליטים ממדיום התרבית. ערבבו וייבשו את שכבת האתיל אצטט של כל אחת מהן באמצעות אידוי סיבובי. ממיסים מחדש את התמצית במתנול מינימלי, מעבירים אותה לבקבוקון קטן ומייבשים אותה שוב על ידי אידוי סיבובי.הערה: אם התמצית מתייבשת לחומר שומני או שרף, בצע ליופיליזציה של החומר כדי לקבל אבקה יבשה שניתן לשקול במדויק. 5. הכנת צלחת TLC הכינו את צלחת TLC בגודל 20 ס”מ על 20 ס”מ על ידי ציור קו 2 ס”מ מלמטה ו-2 ס”מ מהחלק העליון של הצלחת. בשורה התחתונה, הניחו תשע נקודות במרחק של 2 ס”מ זו מזו. מעל הקו העליון, מקמו ארבע נקודות במרחק של 4 ס”מ זו מזו. יש להמיס 5 מ”ג מכל תמצית ב-15 מיקרוליטר מתנול ולמרוח 5 מיקרוליטר מכל תמצית על תשע הנקודות המסומנות בשורה התחתונה באמצעות פיפטה. תן לכל כתם תמצית להתייבש על צלחת TLC ולהחיל עוד 5 μL aliquot על אותה נקודה. חזור על הפעולה עד שכל החומר נטען על צלחת TLC. מפתחים את צלחת TLC במיכל מתפתח באמצעות תמיסה ביחס 1:2 של דיכלורומתאן ומתנול עד שהממס מגיע לקו המסומן 2 ס”מ מראש הצלחת (כ-45 דקות). לאחר הפיתוח, הסר את צלחת TLC והחל סדרה של פקדים חיוביים על ארבע הנקודות המסומנות מעל קו הממס. ארבעה ריכוזים של אותה בקרה משמשים. עבור S. scl., 0.5 מיקרוגרם/מ”ל, 5 מיקרוגרם/מ”ל, 50 מיקרוגרם/מ”ל ו-500 מיקרוגרם/מ”ל של היגרומיצין B הם בקרות חיוביות. לפני שכל הממס מתאדה מהצלחת, הניחו אותו בקופסת צלחת TLC מעוקרת אתנול. 6. בדיקת ביואוטוגרפיה ישירה Autoclave החומרים שישמשו בבדיקה (רכיבי זכוכית של מרסס הכרומטוגרפיה, מרית מתכת, ארבעה גיליונות של מגבת נייר, תאית או נייר פילטר, מים ומדיה) בתוך גדולה מכוסה tinfoil.הערה: חומרי נייר (מגבת נייר, נייר תאית) צריכים להיות עטופים בנייר כסף כדי למנוע הרטבה באוטוקלאב. חבר מקור אוויר, מד לחץ ומרסס כרומטוגרפיה באמצעות צינורות PTFE מעוקרים באתנול. חבר מסנן HEPA בין מרסס הכרומטוגרפיה לבין מד הלחץ. אספו את מחצלת התפטיר של חמשת לוחות הפתוגן באמצעות מרית המתכת הסטרילית לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ”ל באמצעות מרית סטרילית.הערה: השתמשו בכמות קטנה של ציר נוזלי כדי לעזור לעקור את התפטיר במידת הצורך, והעבירו עם פיפטה סטרילית. הוסף 25 מ”ל של PDB מתוקן עם אגר וחרוזי זכוכית סטריליים לצינור הצנטריפוגה 50 מ”ל ולמערבולת למשך 5 דקות כדי לשבור את מחצלת התפטיר. מעבירים את מתלה התפטיר למרסס כרומטוגרפיה באמצעות מזרק סטרילי עם קצה מחט כדי להבטיח שחתיכות גדולות של תפטיר לא יסתמו את מרסס הכרומטוגרפיה. הניחו את לוחות TLC שפותחו בעבר על מגבות נייר סטריליות במכסה מנוע זרימה למינרית כדי להפחית את מגע היד עם הצלחת תוך החלת מתלי המדיה. הגדל את לחץ האוויר לכ -4 ברים והחל שלוש שכבות של המתלה על צלחת TLC, מה שמאפשר לצלחת להתייבש לחלוטין בין היישומים.הערה: שלוש שכבות נמצאו ככמות האופטימלית. פחות מזה, ולפתוגן אין מספיק מדיה לגדול עליה. יותר מזה, התקשורת עבה מדי, אשר לא יכול לאפשר מגע פתוגן עם מטבוליטים פעילים. הוסיפו 500 מ”ל מים סטריליים לקופסת צלחת פלסטיק מעוקרת והניחו יריעות תאית מקופלת מעוקרת או נייר סינון מכל צד כדי לשמור על לחות. הניחו את צלחת הבדיקה השלמה על ארבע צלחות פטרי ריקות בקופסה. דגרו על הבדיקה במשך 3 ימים עד שבוע או עד ששכבה אחידה של תפטיר גדלה באופן שווה על פני צלחת TLC למעט סביב הבקרות החיוביות ואזור העיכוב (ZOIs). 7. ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית צלם את הבדיקה שהושלמה באמצעות צילום. חשב את מקדם השמירה עבור כל אזור עיכוב על-ידי חלוקת המרחק מהשורה התחתונה ל-ZOI במרחק מהשורה התחתונה לקו העליון. מגרדים את הסיליקה מאזורי העיכוב ומניחים אותה בצינורות מיקרוצנטריפוגה. הוסיפו 500 מיקרוליטר מתנול לכל צינור ומערבולת כדי לחלץ את המטבוליטים מהסיליקה. צנטריפוגה ב-8,500 x גרם ב-20°C למשך 10 דקות, ומעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון קטן. להתאדות ליובש על ידי אידוי סיבובי או תחת זרם של חנקן. להשעות מחדש את התמצית ב 50 μL של מתנול בבקבוקון LC. נתח את המטבוליטים באזור העיכוב על ידי LC-MS והשווה אותם למטבוליטים בתמצית הגולמי כדי לקבוע אילו מטבוליטים בתמצית הגולמי אחראים לעיכוב הפתוגן16. באמצעות הסוג והמינים של מיקרואורגניזם המקור והמסות המזוהות ב- ZOI, חפש בספרות ובמאגרי מידע רלוונטיים כגון Antibase ומילון המוצרים הטבעיים כדי לזהות את המטבוליטים.