生物测定 - 通过薄层色谱法 - 直接生物自闭法鉴定用于生物防治的天然产物

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。 1. 选择微生物生物防治候选者 使用竞争板检测，选择对目标病原体表现出拮抗作用的微生物分离物。注：选择了 9 种表现出对菌核链球菌拮抗作用的芽孢杆菌分离株，包括萎缩芽孢杆菌、莫哈文菌和枯草芽孢杆菌物种，以证明该方案。 2. 培养基制备 通过每升水溶解 39 g 培养基来制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA）。 通过每升水添加 45 g 培养基来制备假单胞菌 F 琼脂。 通过每升水添加 24 g 培养基和 0.24 g 琼脂，制备含有 1% 琼脂的马铃薯葡萄糖汤 （PDB）。 准备酵母-葡萄糖-锰 （YGM） 肉汤。制备由 2.5 g KH2PO4 和 2.5 g K2HPO4 溶于 100 mL 水的缓冲溶液，以及由 0.58 g MnSO4 组成的盐溶液。H20、0.5 g NaCl 和 0.05 g FeSO 4.7H20 溶于 100 mL 水中。接下来，加入 1 g 酵母提取物、1.25 g 葡萄糖、400 mL 水、5 mL 缓冲溶液、5 mL 盐溶液和 90 mL 水，以确保金属盐不会在溶液中沉淀。 对培养基进行高压灭菌，将琼脂倒入 100 x 15 mm 培养皿中，并在使用前全部冷却至室温。 3. 病原体制备 在 PDA 上培养五板菌核 病 菌（在步骤 2.1 中制备），并在 25 °C 下孵育 3 天。 4. 天然产物提取物制备 在假单胞菌 F 琼脂（在步骤 2.2 中制备）上培养每个细菌分离物并生长直至观察到单个菌落。 将单个细菌菌落传代培养到离心管或培养管中的 25 mL YGM 培养基中，并在振荡下孵育 3 天。 将每种提取物的 5 mL 等分试样转移到 1 L YGM 中，并在相同条件下再孵育 3 天。 将每种培养物在 25 °C 下以 3000 x g 离心 15 分钟以沉淀细胞。 倒出并用乙酸乙酯洗涤上清液 3 次，以从培养基中提取代谢物。 合并并使用旋转蒸发干燥每个乙酸乙酯层。 将提取物重新溶解在最少的甲醇中，将其转移到一个小闪烁瓶中，然后通过旋转蒸发再次干燥。注：如果提取物干燥成油性或树脂状材料，请将材料冻干以获得可准确称量的干粉。 5. TLC 板制备 通过在距板底部 20 厘米和距板顶部 2 厘米处画一条线来准备 20 厘米 x 20 厘米的 TLC 板。在底线上，放置 9 个点，相距 2 厘米。在顶线上方，放置四个相距 4 厘米的点。 将 5 mg 每种提取物溶解在 15 μL 甲醇中，并使用移液管将 5 μL 每种提取物涂抹在底线上标记的九个点上。让每个提取物点在 TLC 板上干燥，然后将另外 5 μL 等分试样涂到同一点。重复直到所有材料都加载到 TLC 板上。 使用二氯甲烷和甲醇的 1：2 溶液在显影槽中显影 TLC 板，直到溶剂到达距板顶部 2 cm 标记的线（约 45 分钟）。 显影后，取出 TLC 板，并在溶剂线上方标记的四个点上涂抹一系列阳性对照。使用相同对照的四种浓度。对于 S. scl.， 0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL 和 500 μg/mL 潮霉素 B 是阳性对照。 在所有溶剂从板中蒸发之前，将其放入乙醇灭菌的 TLC 板盒中。 6. 直接生物自闭造影测定 将用于测定的材料（色谱喷雾器的玻璃成分、金属刮刀、四张纸巾、纤维素或滤纸、水和培养基）在覆盖有锡纸的大烧杯中高压灭菌。注意：纸质材料（纸巾、纤维素纸）应用锡箔包裹，以避免在高压灭菌器中受潮。 使用乙醇灭菌的 PTFE 管连接气源、压力表和色谱喷雾器。在色谱喷雾器和压力表之间连接 HEPA 过滤器。 使用无菌金属刮刀将五个病原体板的菌丝垫收集到使用无菌刮刀的 50 mL 离心管中。注意：如果需要，使用少量液体肉汤帮助去除菌丝体，并使用无菌移液管转移。 将 25 mL 用琼脂和无菌玻璃珠修饰的 PDB 添加到 50 mL 离心管中，涡旋 5 分钟以打碎菌丝垫。 使用带有针尖的无菌注射器将菌丝体悬浮液转移到层析喷雾器中，以确保大块菌丝体不会堵塞层析喷雾器。 将先前开发的 TLC 板放在层流罩中的无菌纸巾上，以减少在应用培养基悬浮液时手与板的接触。 将气压增加到大约 4 巴，并在 TLC 板上涂上三层悬浮液，让板在两次应用之间完全干燥。注意：发现三层是最佳量。小于这个值，病原体就没有足够的培养基来生长。不仅如此，培养基太厚，可能不允许病原体与活性代谢物接触。 将 500 mL 无菌水加入消毒过的塑料板盒中，并在每侧放置消毒过的折叠纤维素片或滤纸以保持水分。 将完成的分析板放在盒子中的四个空培养皿上。 孵育测定 3 天至 1 周，或直到均匀的菌丝体层在 TLC 板上均匀生长，阳性对照和抑制区 （ZOI） 周围除外。 7. 液相色谱质谱分析 使用摄影对完成的分析进行成像。 通过将底线到 ZOI 的距离除以底线到底线的距离来计算每个抑制区的保留因子。 从抑制区刮下二氧化硅，并将其放入微量离心管中。 向每个试管中加入 500 μL 甲醇并涡旋以从二氧化硅中提取代谢物。 在 20 °C 下以 8,500 x g 离心 10 分钟，然后将上清液转移到一个小瓶中。 通过旋转蒸发或在氮气流下蒸发至干。 将提取物重悬于 LC 样品瓶中的 50 μL 甲醇中。 通过 LC-MS 分析抑制区的代谢物，并将其与粗提取物中的代谢物进行比较，以确定粗提取物中的哪些代谢物负责抑制病原体16。 使用 ZOI 中鉴定的源微生物的属和种以及质量，搜索文献和相关数据库（如 Antibase 和 Dictionary of Natural Products）以鉴定代谢物。