Identificación guiada por bioensayos de productos naturales para el biocontrol mediante cromatografía en capa fina-Bioautografía directa

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. 1. Selección de los candidatos a biocontrol microbiano Mediante ensayos de placa de competición, seleccione aislados microbianos que muestren antagonismo contra el patógeno de interés.NOTA: Se seleccionaron nueve aislados de Bacillus que exhibieron antagonismo contra S. sclerotiorum , incluyendo las especies de Bacillus atrophaeus, mojavensis y subtilis , para demostrar este protocolo. 2. Preparación de los medios Preparar agar patata dextrosa (PDA) disolviendo 39 g de medio por litro de agua. Prepare Pseudomonas F agar añadiendo 45 g de medio por litro de agua. Preparar caldo de patata dextrosa (PDB) con agar al 1% añadiendo 24 g de medio, y 0,24 g de agar por litro de agua. Prepare el caldo de levadura-glucosa-manganeso (YGM). Cree una solución tampón que consista en 2,5 g de KH2PO4 y 2,5 g de K2HPO4 en 100 ml de agua, y una solución salina que consista en 0,58 g de MnSO4. H20, 0,5 g de NaCl y 0,05 g de FeSO 4,7H20 en 100 mL de agua.A continuación, agregue 1 g de extracto de levadura, 1,25 g de dextrosa, 400 mL de agua, 5 mL de la solución tampón, 5 mL de la solución salina y 90 mL de agua para asegurarse de que las sales metálicas no precipiten en la solución. Esterilizar el medio en autoclave, verter el agar en placas de Petri de 100 x 15 mm y dejar enfriar todo a temperatura ambiente antes de usarlo. 3. Preparación de patógenos Cultivar cinco placas de Sclerotinia sclerotiorum en PDA (preparado en el paso 2.1) e incubar a 25 °C durante 3 días. 4. Preparación del extracto de producto natural Cultive cada aislado bacteriano en agar Pseudomonas F (preparado en el paso 2.2) y crezca hasta que se observen colonias individuales. Subcultive colonias bacterianas individuales en 25 mL de medio YGM en tubos de centrífuga o cultivo e incube agitando durante 3 días. Transfiera 5 mL de alícuotas de cada extracto a 1 L de YGM e incube en las mismas condiciones durante otros 3 días. Centrifugar cada cultivo a 3000 x g durante 15 min a 25 °C para granular las células. Decantar y lavar el sobrenadante tres veces con acetato de etilo para extraer los metabolitos del medio de cultivo. Combine y seque la capa de acetato de etilo de cada uno mediante evaporación rotativa. Vuelva a disolver el extracto en un mínimo de metanol, transfiéralo a un pequeño vial de centelleo y séquelo nuevamente por evaporación rotativa.NOTA: Si el extracto se seca hasta convertirse en un material aceitoso o resinoso, liofililice el material para obtener un polvo seco que se pueda pesar con precisión. 5. Preparación de la placa TLC Prepara el plato TLC de 20 cm x 20 cm dibujando una línea a 2 cm de la parte inferior y a 2 cm de la parte superior del plato. En la línea inferior, coloque nueve puntos a 2 cm de distancia. Encima de la línea superior, coloque cuatro puntos a 4 cm de distancia. Disolver 5 mg de cada extracto en 15 μL de metanol y aplicar 5 μL de cada extracto en los nueve puntos marcados en la línea inferior con una pipeta. Deje que cada mancha de extracto se seque en la placa TLC y aplique otras 5 μL de alícuota en la misma mancha. Repita hasta que todo el material esté cargado en la placa TLC. Revele la placa TLC en un tanque de revelado utilizando una solución 1:2 de diclorometano y metanol hasta que el solvente alcance la línea marcada a 2 cm de la parte superior de la placa (aproximadamente 45 min). Una vez desarrollado, retire la placa TLC y aplique una serie de controles positivos en los cuatro puntos marcados sobre la línea de disolvente. Se utilizan cuatro concentraciones del mismo control. Para S. scl., 0,5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL y 500 μg/mL de higromicina B son controles positivos. Antes de que todo el solvente se evapore de la placa, colóquela en una caja de placa TLC esterilizada con etanol. 6. Ensayo de bioautografía directa Esterilizar en autoclave los materiales que se utilizarán en el ensayo (componentes de vidrio del pulverizador de cromatografía, espátula metálica, cuatro hojas de papel toalla, celulosa o papel de filtro, agua y medios) en un vaso de precipitados grande cubierto con papel de aluminio.NOTA: Los materiales de papel (toalla de papel, papel de celulosa) deben envolverse en papel de aluminio para evitar que se mojen en el autoclave. Conecte una fuente de aire, un manómetro y un rociador de cromatografía utilizando un tubo de PTFE esterilizado con etanol. Conecte un filtro HEPA entre el pulverizador de cromatografía y el manómetro. Recoja la estera micelial de las cinco placas de patógenos con la espátula de metal estéril en un tubo de centrífuga de 50 ml con una espátula estéril.NOTA: Use un pequeño volumen de caldo líquido para ayudar a desalojar los micelios si es necesario, y transfiéralo con una pipeta estéril. Agregue 25 mL de PDB modificado con agar y perlas de vidrio estéril al tubo de centrífuga de 50 mL y vórtice durante 5 min para romper la estera micelial. Transfiera la suspensión micelial a un rociador de cromatografía usando una jeringa estéril con una punta de aguja para asegurarse de que los trozos grandes de micelio no obstruyan el rociador de cromatografía. Coloque las placas TLC desarrolladas anteriormente sobre toallas de papel estériles en una campana de flujo laminar para reducir el contacto de las manos con la placa mientras aplica la suspensión de medios. Aumente la presión de aire a aproximadamente 4 bares y aplique tres capas de la suspensión a la placa TLC, permitiendo que la placa se seque completamente entre aplicaciones.NOTA: Se encontró que tres capas es la cantidad óptima. Menos que esto, y el patógeno no tiene suficientes medios para crecer. Más que esto, el medio es demasiado espeso, lo que puede no permitir el contacto de patógenos con metabolitos activos. Agregue 500 ml de agua estéril en una caja de plástico esterilizada y coloque hojas de celulosa dobladas esterilizadas o papel de filtro en cada lado para retener la humedad. Coloque la placa de ensayo completa en cuatro placas de Petri vacías en la caja. Incube el ensayo durante 3 días a 1 semana o hasta que una capa uniforme de micelio crezca uniformemente a través de la placa TLC, excepto alrededor de los controles positivos y la zona de inhibición (ZOI). 7. Análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida Tome una imagen del ensayo completado utilizando fotografía. Calcule el factor de retención para cada zona de inhibición dividiendo la distancia desde la línea inferior hasta la ZOI por la distancia desde la línea inferior hasta la línea superior. Raspe la sílice de las zonas de inhibición y colóquela en tubos de microcentrífuga. Agregue 500 μL de metanol a cada tubo y vórtice para extraer los metabolitos de la sílice. Centrifugar a 8.500 x g a 20 °C durante 10 min y transferir el sobrenadante a un vial pequeño. Evaporar hasta la sequedad por evaporación rotativa o bajo una corriente de nitrógeno. Vuelva a suspender el extracto en 50 μL de metanol en un vial de LC. Analizar los metabolitos en la zona de inhibición por LC-MS y compararlos con los metabolitos en el extracto crudo para determinar qué metabolitos en el extracto crudo son responsables de la inhibición del patógeno16. Utilizando el género y la especie del microorganismo fuente y las masas identificadas en la ZOI, busque en la bibliografía y en las bases de datos pertinentes, como Antibase y el Dictionary of Natural Products, para identificar los metabolitos.