박층 크로마토그래피에 의한 생물제어를 위한 천연물의 생물학적 분석 유도 식별-직접 생체 자폐 촬영
概要
병원균 Sclerotinia sclerotiorum 및 생물 살충 Bacillus isolates 를 모델 시스템으로 사용하여 진균 병원체에 대한 길항 작용을 나타내는 미생물 천연 제품을 식별하기 위해 박층 크로마토그래피, 직접 생체 자폐 분석 분석 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
박층 크로마토그래피-직접 생체 자폐학(TLC-DB)은 표적 병원체에 대해 길항작용이 있는 천연 제품(NP)을 분리하고 식별하는 데 사용되는 잘 정립된 생물학적 분석법입니다. 이는 생물 활성을 검사하기 위해 표적 병원체의 직접 적용과 함께 TLC에 의한 분리에 의존하는 NP의 생물학적 검정 유도 분리 및 식별을 위한 빠르고 저렴하며 간단한 옵션입니다. 일반적으로 생체 활성 식물 추출물 분석에 사용되며 박테리아, 곰팡이 및 효소에 대한 억제 활성을 감지합니다. 즉, 박테리아 NP 발견, 특히 관련 농업 병원체에 대한 박테리아 NP를 평가하는 데 큰 잠재력을 가지고 있으며, 이는 농업 산업을 위한 새로운 생물 살충제를 발견하고 개발하는 데 유용합니다. 또한, 생체 활성 화합물의 발견 및 식별에 관한 연구 프로그램에서 다른 표적 병원체 또는 NP의 소스에 적용할 수 있는 조정 가능한 프로토콜입니다. 여기에서는 Bacillus spp. 및 농업 병원균 Sclerotinia sclerotiorum과 함께 TLC-DB를 사용하여 생물 농약 NP를 발견하고 식별하기 위한 모델 시스템을 설명합니다.
Introduction
곰팡이 농업 병원균은 전 세계적으로 작물 품질과 수확량에 심각한 손실을 초래하여 안정적인 글로벌 식량 생산 시스템의 경제적 및 공급 문제에 기여합니다 1,2. 병원균 피해는 감염에 저항력이 있는 품종을 육종하고 병원균 증식을 억제하기 위한 작물 순환 및 토지 관리 관행을 포함한 통합 작물 관리 시스템을 사용함으로써 예방할 수 있다 3,4. 이러한 방법은 작물에 대한 피해를 줄이지만 일반적으로 화학 살충제는 현장의 곰팡이 생식 구조를 적극적으로 죽이고 더 나아가 피해와 수확량 감소를 방지하기 위해 함께 사용됩니다. 화학 살충제 사용은 효과적이지만 주변 생태계 손상, 토양 비옥도 감소, 관련 인체 건강 위험, 병원체 내성 발달 등 많은 단점이 있으며, 후자는 매년 더 많은 양의 살충제가 필요하게 됩니다 5,6,7.
미생물 기반 해충 및 병원균 관리 제품은 오랫동안 합성 살충제의 잠재적인 대안 또는 보완물로 간주되어 왔습니다. 1900년대 초반부터 Bacillus thuringiensis 는 종자 처리, 엽면 살포 및 직접 토양 처리로 농업 해충 및 병원균을 방제하는 데 널리 사용되어 왔다8. 이러한 제품은 생물 살충제로 명명되었으며 대상 해충 또는 병원체의 활력을 죽이거나 억제하거나 감소시킬 수 있는 자연 발생 미생물 또는 생화학 물질로 특성화됩니다. 생물살충제는 다양한 메커니즘을 통해 병원체의 성장을 제어할 수 있지만, 가장 일반적으로 2차 대사산물의 분비를 통해 조절한다9. 종종 천연물이라고 불리는 2차 대사산물은 1차 대사에 관여하지 않지만 다른 미생물을 능가하기 위한 진화적 이점으로 생산됩니다10.
생물 살충제는 합성 살충제에 비해 많은 이점을 제공합니다. 그들은 합성 해충 관리 제품에 비해 환경, 동물 군 및 인간에 대한 독성 위험이 낮습니다 9,10. 대부분의 생물농약은 수천 년 동안 환경에 자연적으로 존재해 왔기 때문에 미생물 대사 산물에 대한 생분해 경로가 환경에 존재하여 토양 또는 생태계 오염 가능성을 제한하고 합성 살충제가 환경을 파괴하는 데 기여하는 체류 시간을 줄입니다11. 또한 병원체 감염을 완화하기 위해 사용되는 많은 생물살충제는 식물 성장 촉진 특성을 나타내어 영양소 생체이용률을 높이고 식물 전신 저항성을 유발할 수 있습니다12.
가장 일반적으로 생물 살충제는 미생물 접종물의 형태로 적용되며 NP는 살아있는 미생물에 의해 현장에서 분비됩니다 12,13. 이러한 경우 생물 살충제의 활성 원인을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 이를 통해 생물 살충제의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 얻고, 특허를 통해 미생물을 보호하기 위한 사례를 구축하는 데 도움이 되며, 구조가 새로운 경우 상당한 과학적 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 가장 중요한 것은 생체 활성 공급원의 식별이 다운스트림 생물 살충제 제품의 제형 가능성을 알려주는 것입니다. NP 자체가 활성화되면 미생물을 대규모 생물 살충제 생산을 위한 생체 분자 공장으로 사용할 수 있습니다. 또한, 생물 제어를 위해 연구된 많은 NP는 인간 의학에서도 잠재적으로 응용될 수 있어 경제적으로 훨씬 더 가치가 있습니다8.
박층 크로마토그래피-직접 생체 자폐학(TLC-DB) 분석은 생물 살충 대사 산물의 생체 활성 유도 분리 및 식별을 위한 저렴하고 간단한 방법입니다. 이 기법은 조잡한 식물 추출물에서 식물 화학물질의 생체 활성 검사를 분리하는 데 일반적으로 사용되지만, 미생물 추출물 분석에도 큰 잠재력을 가지고 있습니다14. TLC는 미생물 추출물에서 NP를 빠르고 저렴하게 분리할 수 있으며, 매체 병원균 현탁액으로 코팅한 후 활성 대사 산물이 포함된 영역을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이러한 영역은 플레이트에서 긁어내고 알려진 대사 산물을 식별하기 위해 질량 분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피로 화학 분석을 위해 추출할 수 있습니다. 이전에 보고된 화합물과 일치하지 않는 대사 산물은 액체 크로마토그래피를 통해 대량으로 분리하여 핵 자기 공명 분광법 및 X선 결정학과 같은 기술을 사용하여 구조 규명 연구를 수행할 수 있습니다15.
이 기사에서는 Bacillus spp. 및 농업 병원균 Sclerotinia sclerotiorum과 함께 TLC-DB를 사용하여 생물 살충제 NP를 발견하고 식별하기 위한 모델 시스템에 대해 설명합니다. 그림 1 은 TLC-DB 절차의 개략적인 개요를 제공합니다.
그림 1: TLC-DB 절차의 4-7단계에 대한 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
TLC-DB는 가치 있고 잘 정립된 NP 연구 도구이며 마이크로플레이트 생물학적 검정 유도 분리 방법에 대한 간단하고 저렴한 대안입니다17. 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 대사 산물 분리가 필요한 마이크로플레이트 분석에 비해 최소한의 시간과 재료 자원이 필요합니다. 효소 억제제 18,19,20,21,22,23 외에도 항균, 항진균, 항기생충 및 항산화 NP를 검출하는 데 사용할 수 있는 매우 다재다능한 분석법입니다. 생체 활성 식물 화학 물질을 검출하고 식별하는 데 가장 일반적으로 사용되지만, 이 프로토콜18에서 탐구된 바와 같이 박테리아 NP에 동일한 방법을 적용할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 새로운 생체 활성 NP를 발견하고 평가하는 데 도움이 되도록 다양한 NP 소스 및 표적 병원체와 함께 사용하도록 최적화할 수 있습니다.
박테리아 성장에 사용되는 배지와 추출에 사용되는 용매는 천연 제품 발견 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 배지는 슈도모나스(Pseudomonas ) 및 바실러스 종(Bacillus spp)을 포함한 고리형 리포펩타이드를 생성하는 박테리아에 최적화되어 있습니다. 그러나 다른 속을 탐색하는 경우 다른 매체와 영양 공급원을 고려해야 합니다. 다양한 배지에서 성장한 동일한 미생물을 사용하여 TLC-DB를 완성하여 하나의 분리물에서 대사 산물 다양성의 전체 범위를 평가하거나 더 넓은 범위의 분리체에 대해 동일한 성장 조건을 사용할 수 있습니다. 추출 용매의 선택은 검출된 천연 제품에도 영향을 미칩니다. 일반적으로 대부분의 생체 활성 NP는 극성이 낮거나 중간 정도인 것으로 이해되며, 끓는점이 낮아 쉽게 제거할 수 있기 때문에 에틸 아세테이트가 적합한 선택입니다. 그러나 극성 및 비극성 분획도 검사하려는 경우 다른 용매를 사용하여 여러 번 추출할 수 있습니다. 또는 cell-free 추출물을 동결건조하여 분석에 사용하여 모든 대사 산물이 매체로 방출되는 것을 확인할 수 있습니다. 그러나 동결건조된 재료의 건조된 매체 구성 요소를 설명하기 위해 TLC 플레이트에 더 많은 재료를 로드해야 하는 경우가 많습니다. 마찬가지로, 이 방법을 inoculum과 같은 다른 병원체와 함께 사용하는 경우 TLC-DB 분석에 사용되는 균사체의 5개 한천 플레이트를 얻기 위해 사용되는 배지와 배양 조건을 최적화해야 합니다.
TLC-DB는 한천과 접종물의 가장 얇은 층을 사용하기 때문에 접촉 및 침지 생체 자폐 촬영에 비해 유리하며, 이는 한천 층으로의 대사 산물의 확산에 대한 의존도를 최소화하여 더 적은 양의 천연 산물이 병원균 억제를 유도할 수 있도록 할 수 있습니다17. TLC 생체 자사 방법을 사용하여 이전에 발표된 연구 결과는 병원체의 포자 현탁액을 사용하여 분석을 완료했습니다17. 비록 이것이 현탁액 농도에 대한 정밀한 제어를 허용하지만, 특정 균류(24)의 포자형성을 유도하는 것은 대단히 어렵고 시간이 많이 걸릴 수 있다. 이 수정은 분석을 크게 단순화하고 포자가 발생하기 어렵고 이전에 이 방법에서 피했을 수 있는 곰팡이 병원체를 사용하여 분석을 완료할 수 있습니다.
분석에 사용된 박테리아 추출물의 질량은 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. TLC 플레이트에 너무 적은 추출물을 적용하면 활성 화합물의 최소 억제 농도를 초과하지 않고 생체 활성이 검출되지 않을 수 있습니다. 결과적으로, 그림 1 및 그림 2에서 볼 수 있듯이 경우에 따라 TLC 플레이트에 과부하를 일으켜 활동을 쉽게 감지할 수 있는 기능을 위해 분리를 손상시키는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 플레이트에 분사되는 병원균 부하가 너무 낮아서는 안 되는데, 이는 병원균 성장을 지원하기 위해 충분한 매체가 적용되지 않기 때문입니다. 이 방법은 다양한 박테리아 추출물 및 병원체를 수용하도록 쉽게 조정할 수 있으며, 프로토콜에 설명된 미생물 추출물 및 접종물의 양은 여러 병원체 및 미생물 추출물에 대한 생체 활성을 검출할 수 있도록 보장했습니다. 분석 완료 시 억제 영역이 관찰되지 않으면 다음 중 하나를 나타낼 수 있습니다. 첫째, 활성 대사 산물은 박테리아 성장에 사용되는 호환되지 않는 매체 또는 NP 생성의 결과가 아닌 박테리아의 활동으로 인해 적용된 추출물에 존재하지 않을 수 있습니다. 추출물을 사용한 디스크 확산 분석을 완료하여 추출물에 활성 NP의 존재를 확인하거나 거부할 수 있습니다. 디스크 확산 분석에서 병원균 억제가 나타나지 않으면 다른 매체를 테스트하여 다른 조건이 생체 활성 NP를 생성하는지 확인할 수 있습니다. 디스크 확산 분석에서 추출물이 병원체를 억제하는 것으로 나타나면 더 많은 양의 박테리아 추출물을 TLC 플레이트에 적용해야 할 수 있으며, 이 경우 다른 분석을 시도할 수 있습니다.
ZOI의 대사 산물을 미정제 추출물과 비교하는 것은 활성 NP를 식별하는 데 필수적입니다. 분석에서 미정제 추출물의 대사 산물은 병원체에 의해 대사되거나 변형될 수 있으며, 이는 LC-MS를 통해 관찰할 수 있습니다. 따라서 미정제 추출물과 ZOI 모두에서 발생하는 대사 산물만이 연구 중인 박테리아에 의해 생성된 NP로 간주될 수 있습니다. ZOI에서 추출한 대사 산물을 미가공 추출물의 대사 산물과 연관시킬 수 없는 경우, 5단계에서 설명한 대로 TLC 플레이트를 준비할 수 있습니다. 생체 autography 분석을 완료하지 않고 완료된 분석에서 관찰된 것과 동일한 머무름 시간에 TLC 플레이트에서 대사 산물을 추출합니다. 이렇게 하면 ZOI의 대사 산물과 미정제 추출물 사이의 상관 관계를 더 쉽게 파악할 수 있어 병원균 억제를 유발할 수 있습니다.
TLC-DB의 한 가지 단점은 TLC의 분리능이 분리를 위해 액체 크로마토그래피가 필요한 기존 마이크로웰 스크리닝 기술을 사용할 때 달성되는 것보다 훨씬 낮다는 것입니다. 따라서, 일부 대사 산물이 생체 활성에 기여하지 않을 수 있는 억제 영역에 여러 대사 산물이 존재하는 것이 일반적입니다. 이 문제는 생체 활성을 보다 명확하게 관찰하기 위해 TLC 플레이트에 과부하를 가하는 관행으로 인해 더욱 발생할 수 있습니다. 최근 연구는 고성능 TLC(HP-TLC)를 사용하여 발표되었는데, 이는 해상도를 크게 향상시키고 기존의 TLC 14,21,22,23을 사용할 때 불가능한 TLC 개발의 자동화를 허용할 수 있습니다. 또한 플레이트를 2차원(2D-TLC)으로 개발하여 유사한 머무름 시간을 가진 대사 산물을 추가로 분리할 수 있습니다. 즉, 증가된 시간 및 재료 비용이 HP 및 2D-TLC25에서 얻은 향상된 해상도를 위한 가치 있는 절충안인지 평가해야 합니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구를 가능하게 한 자금 지원(프로젝트 J-001843 및 J-002021)에 대해 캐나다 농업 및 농식품부(Agriculture and Agri-Food Canada)에 감사드립니다. 이 프로토콜의 비디오 콘텐츠를 촬영해 주신 Brett van Heyningen에게 감사드립니다. 또한 이 원고에 설명된 방법에 대한 통찰력을 제공한 이전 대학원생(Jennifer Vacon과 Mark Nabuurs)에게도 감사드립니다.
Materials
| 0.5-5 mL single channel Pipette | VWR | CA11020-004 | |
| 10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer | VWR | KT422530-0010 | |
| 100 x 15 mm Petri plates | VWR | 89038-970 | |
| 100-1000 µL pipette tips | VWR | 76322-164 | |
| 100-1000 µL single channel pipette | VWR | 76169-240 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | VWR | CA21008-918 | |
| 1 L glass bottle | Millipore Sigma | CLS13951L | Must be autoclave safe |
| 1 mL sterile syringe with needle | Thomas Scientific | 8935L75 | Detachable needle is recommended |
| 2 mL Microcentrifuge tube | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | VWR | CA21008-940 | |
| 5 mL pipette tips | VWR | CA11020-008 | |
| 7 mL scintilation vials | VWR | 76538-962 | |
| 95% ethanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Autoclave | Cole-Parmer | UZ-01850-34 | 8 L, 115 VAC |
| Bacteriological agar | VWR | 97064-336 | |
| bin | Thomas Scientific | 1216H91 | |
| D-Glucose | VWR | BDH9230-500G | |
| Dichloromethane ≥99.8% ACS | VWR | BDH1113-4LG | |
| Ethyl Acetate ≥99.8% ACS | VWR | BDH1123-4LG | |
| Filter paper | VWR | CA28297-846 | |
| Grinding Beads | VWR | 12621-148 | |
| Hygromycin B | VWR | CA80501-074 | |
| Iron Sulfate Heptahydrate | VWR | 97061-542 | |
| Laminar flow hood | CleanTech | 1000-6-A | |
| LC-MS | Waters | LITR10064178 | UPLC/MS/MS TQD system |
| Lyophilizer | Labconco | 700201000 | Temperature collector -50 °C |
| Manganese Sulfate Hydrate | VWR | CAAA10807-14 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR | BDH2018-5GLP | |
| Paper towel | VWR | 89402-824 | |
| Potato Dextrose Agar | VWR | CA90000-758 | |
| Potato Dextrose Broth | VWR | CA90003-494 | |
| Potsasium Phosphate Dibasic | VWR | 470302-246 | |
| Potsasium Phosphate Monobasic | VWR | 470302-252 | |
| Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi) | Tameson | F25U6 | |
| Pseudomonas F Agar | VWR | 90003-352 | Also known as Flo Agar |
| PTFE Tubing | Sigma Aldrich | 58697-U | 1/16 inch inner diameter |
| Sodium Chloride | VWR | BDH9286-500G | |
| Spatula | VWR | 82027-490 | |
| Sterile Inoculation loops with needle | VWR | 76534-512 | |
| Tinfoil | Thomas Scientific | 1086F24 | Can be purchased from supermarket |
| TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm | Thomas Scientific | 1205Q12 | |
| Vacuum Pump | Labconco | 1472100 | 98 L/min |
| Vortex | VWR | 76549-928 | Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes |
| Whatman in-line HEPA-VENT | Millipore Sigma | WHA67235000 | 10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet |
| VWR | 97063-370 |
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