概要

mRNA およびタンパク質解析のためのマウスの涙液採取の最適化

Published: July 19, 2024
doi:

概要

マウスモデルの涙からRNAおよびタンパク質バイオマーカーを同定することは、さまざまな疾患の早期診断に大きな期待が寄せられています。この原稿は、マウスの涙液からのmRNAおよびタンパク質単離の有効性と効率を最適化するための包括的なプロトコルを提供します。

Abstract

涙液膜は、眼の表面だけでなく、他の組織や臓器の病理に関連する分子変化を反映できる非常に動的な生体流体です。この生体液の分子分析は、疾患の診断またはモニタリング、治療効果の評価、および可能なバイオマーカーの特定のための非侵襲的な方法を提供します。サンプル量が限られているため、涙液サンプルの収集には、高品質と最大の効率を確保するための特定のスキルと適切なツールが必要です。さまざまな涙液サンプリング方法論が人間の研究で説明されています。この記事では、実験動物モデル、特にマウスから涙液関連のタンパク質情報を抽出するために特別に調整された、最適化されたプロトコルの包括的な説明を示します。この方法には、生後2ヶ月齢のマウスにおける涙液産生の薬理学的刺激、続いてシルマーストリップを用いたサンプル採取、および標準的な手順、SDS-PAGE、qPCR、およびデジタルPCR(dPCR)によるプロトコールの有効性と効率の評価が含まれます。このプロトコールは、さまざまな実験パラダイムにおける涙液タンパク質のシグネチャーの研究に容易に適合させることができます。動物モデル用の手頃な価格で標準化され、最適化された涙液サンプリングプロトコルを確立することで、ヒトと動物の研究の間のギャップを埋め、トランスレーショナルスタディを促進し、眼疾患および全身疾患研究の分野における進歩を加速することを目的としています。

Introduction

涙液は血漿限外濾過液と考えられており、血漿血清と脳脊髄液の中間体液としても説明されていますそれらが共有する生体分子の大幅な重複により1。ヒトの涙液には、タンパク質、涙液脂質、代謝物、電解質が含まれていることが報告されています2。最近では、mRNA、miRNA、細胞外小胞などの他の生体分子も同定されている3,4,5,6,7。

人間では、基底の涙は涙液膜にあり、これは3つの層で構成されています:外側の脂質層は、涙液の表面を滑らかに保ち、涙液の蒸発を防ぎます。目の水分を保ち、バクテリアをはじき、角膜を保護し、涙液膜の90%を構成する中央の水層。そして最後に、角膜と接触し、涙液が眼に付着することを可能にする高分子量タンパク質のファミリーであるムチン層8。眼表面全体の涙液の分布は、涙腺からの分泌から始まります。次に、この液体は涙管を通って目の表面を通過し、ドレナージチャネルに流れ込みます。まばたきをするたびに、涙が目全体に均一に分散し、しっとりとした状態を保ちます9

涙液膜は、眼球表面だけでなく、他の組織や臓器でも発生する分子変化を反射できる非常にダイナミックな生体流体です。この生体液における差次的発現の解析は、ヒト疾患におけるバイオマーカーの発見のための有望なアプローチである10,11。涙液膜をバイオマーカーの供給源として利用することは、さまざまな病状における早期診断のためのバイオマーカーの供給源であり、非侵襲的な収集方法の存在によって大幅に促進されてきました。ヒトおよび獣医診療所で涙を採取するための最も一般的な方法は、毛細管現象の原理に基づいて作動する膜ベースの支持体(シルマーストリップ)を含み、涙の中の水が被験者の下部結膜嚢12,13,14に配置された紙の試験紙または毛細管の長さに沿って移動することを可能にする.この方法を通じて少量のサンプルを得るという固有の制限にもかかわらず、種々の高感度技術を用いた涙液組成の生化学的分析は、潜在的なバイオマーカー分子の同定を容易にした11,15。ヒト患者におけるシルマーストリップおよびキャピラリーからの涙タンパク質の溶出を最適化および評価するためのプロトコルは、十分に文書化されています16,17。しかし、実験動物モデルから涙液に関連する分子情報を抽出するために特別に設計された最適化されたプロトコルの完全な説明は入手可能ですが、ほとんどありません。涙腺18の直接刺激による涙液誘導のような既存の方法は、より大きな量の収集を可能にする一方で、侵襲的であり、動物に不快感を与える可能性がある。眼表面から涙液を採取するなどの非侵襲的な方法は、DNAおよびmiRNAを単離する方法として説明されている19,21

このプロトコルは、マウスの涙を収集して処理するための費用対効果が高く最適化された方法を確立することを目的としています。この方法は、非侵襲性を優先しながら、SDS-PAGE、qPCR、dPCRなどの技術による分子分析に適した十分な涙液量を取得します。抽出されたタンパク質とmRNAの含有量情報は、既存の疾患の実験モデルにおける潜在的なバイオマーカーを特定するために利用することができます。

Protocol

ここに記載されているすべての手順は、Cinvestavの動物倫理委員会(CICUAL、#0354/23)によって承認されました。実験動物は、ジャーナルの動物使用ガイドラインと、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に従って厳密に取り扱われ、取り扱われました。処置前後の眼の健康は、眼の分泌物、まぶたの腫れ、眼の異常、および行動の変化?…

Representative Results

この論文に記載されているプロトコルは、ほとんどの分子生物学研究室で一般的に利用可能な技術を使用して、涙液から分子情報を取得するための簡単で手頃な方法を提供します。さらに、酵素活性検出にELISAなどの高感度技術を採用することで、プロトコルをスケールアップすることができます。 これらの処置後、総タンパク質収量は約3〜4μg/μLでした。クマシー染色…

Discussion

涙液は容易に入手でき、涙液中のバイオマーカーの測定は、さまざまなヒト疾患の早期診断のための成功した補完技術として採用することができる27。実験動物モデルにおける涙液組成の生化学的解析は、このアプローチを補完し、疾患の分子基盤の理解における大きな進歩を約束しますが、利用可能なデータやプロトコルが不足しているため、開発に至りました。このレ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、VELUX STIFTUNG[プロジェクト1852]からM.L.への支援を受け、CONAHCYTからM.B.(836810)、E.J.M.C.(802436)、A.M.F.(CVU 1317418)への大学院フェローシップ助成金によって支援されました。研究室、Centro de Investigación sobre el Envejecimiento、Departamento de Farmacobiología (Cinvestav)の全てのメンバーに対し、刺激的な議論に貢献してくださったことに心から感謝申し上げます。

Materials

2-mercaptoethanol Gibco 1985023
2x Laemmli buffer Bio-Rad 16-0737
Acetic Acid Quimica Meyer 64-19-7
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
Bradford Reagent Sigma-Aldrich B6916
Chloroform Sigma-Aldrich 1003045143
Coomassie Blue R 250 US Biological 6104-59-2
Ethanol Quimica Rique 64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder Thermofisher scientific SM1331
Glycerol US Biological G8145
Glycine SANTA CRUZ SC- 29096
Glycogen Roche 10901393001
HCl Quimica Rique 7647-01-0
Isopropyl alcohol Quimica Rique 67-63-0
Methanol Quimica Meyer 67-56-1
Micro tubes 1.5 ml Axygen MCT-150-C
Micro tubes 600 µl Axygen MCT-060-C
NaCl Sigma-Aldrich S3014
PCR tubes & strips Novasbio PCR 0104
Pilocarpine Sigma-Aldrich P6503-10g
Protease inhibitor Roche 11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL) Qiagen 250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10) Qiagen 250001
Real qPlus 2x Master Mix Green Ampliqon A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit Thermofisher scientific K1622
Schirmer's test strips Laboratorio Santgar SANT1553
SDS Sigma-Aldrich L3771
TEMED Sigma aldrich 102560430
TRI reagent Sigma-Aldrich T9424-200ML monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris US Biological T8650
Tris base Chem Cruz sc-3715A

参考文献

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記事を引用
Bello, M., Morales-Farfán, A., Martínez-Colín, E. J., Lezama, I., Lamas, M. Optimizing Tear Collection in Mice for mRNA and Protein Analysis. J. Vis. Exp. (209), e66955, doi:10.3791/66955 (2024).

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