ここでは、さまざまな根圏土壌から相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを確立するための迅速かつ標準化された手順を紹介します。これは、複雑な根圏土壌微生物叢を調査し、シミュレートするために設計された独自のプロトコルです。
マルチスピーシーズバイオフィルムは、根圏土壌を含む自然界のバクテリアの自然発生的で支配的なライフスタイルですが、現在の理解は限られています。ここでは、相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを迅速に確立するためのアプローチを提供します。最初のステップは、示差遠心分離法を使用して根圏土壌から細胞を抽出することです。その後、これらの土壌細胞を培地に接種して、ペリクルバイオフィルムを形成します。インキュベーションの36時間後、バイオフィルムとその下の溶液の細菌組成を、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング法を使用して決定します。一方、ペリクルバイオフィルムからのハイスループット細菌分離は、限界希釈法を使用して行われます。次に、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングデータ(ペリクルバイオフィルムサンプル)で最も存在量の多い上位5つの細菌分類群を選択し、多種バイオフィルムコミュニティの構築にさらに使用します。5つの細菌分類群のすべての組み合わせは、24ウェルプレートを使用して迅速に確立され、クリスタルバイオレット染色アッセイによって最も強いバイオフィルム形成能力が選択され、qPCRによって定量されました。最後に、最も堅牢な合成細菌の多種バイオフィルムコミュニティを上記の方法で取得しました。この方法論は、根圏多種バイオフィルムの研究を行い、これらの種間の相互作用を支配する原理を研究するための代表的なコミュニティを特定するための有益なガイダンスを提供します。
バイオフィルムは、表面に付着しているか、界面に結合している複雑な微生物群集を表しています。自然の生息地、臨床現場、産業環境など、さまざまな環境で遭遇する細菌の大部分は、バイオフィルムコミュニティ内で存続していることは広く認識されています1。土壌では、根の表面とそれに隣接する厚さ2 mmの領域を含む根圏は、栄養の利用可能性が高まった生態学的ニッチを形成します。特定の細菌は、このニッチを利用するための戦略を進化させ、微生物の増殖を促進し、根圏2でのバイオフィルムコミュニティの形成を促進しました。
根圏微生物は植物の「第2のゲノム」と考えられています3。植物生長促進微生物(PGPM)は、植物と共生し、生育促進と生物制御機能4を発現します。一方では、PGPMは植物の根に栄養素を供給し、栄養素の取り込みを促進し、病原体から防御し、根圏土壌の汚染物質を分解することができます5。一方、PGPMは、植物の根の滲出液を成長と進化の栄養源として利用し、それによって根圏の土壌と根系に独自の代謝を通じて影響を与えます。これらすべての機能の前提条件は、植物の根圏におけるPGPMの効果的なコロニー形成であり、安定したバイオフィルムを形成することであることは注目に値します6。
根圏バイオフィルムは根圏微生物の集合過程に影響を及ぼし、根圏微生物集合の時間的・空間的特性は多種バイオフィルムの相互作用と密接に関連している7。植物とマイクロバイオームの相互作用のハブとして機能し、植物が効果的に相互作用するための安定した制御可能なニッチを提供します。したがって、根圏バイオフィルムの研究は、植物と微生物の相互作用についての洞察を得るための重要な方向性でもあります。
しかし、現在、根圏の多種バイオフィルムに関する研究はほとんどありません。マイクロバイオームの構成は非常に複雑であるため、天然の微生物群集を取り巻く基本的な生態学的問題に答えることが難しくなっています8。実験の過程では、土壌の種類、植物の種類、多数の微生物群集など、多くの条件を考慮する必要があります。根圏マルチスピーシーズバイオフィルムの研究には、さまざまな要因が限界があります。
種間相乗相互作用や代謝物クロスフィーディング8など、根圏土壌からの多種バイオフィルムコミュニティをさらに調査するためには、実験室条件下で単純化された、代表的な、安定的で扱いやすい合成微生物コミュニティを人工的に構築することが望ましい9,10。ここでは、標準化されたプロトコルが、最新の微生物学的およびバイオインフォマティクス技術のいくつかを組み合わせています。
プロトコルに従って、一連の堅牢な合成多種バイオフィルムコミュニティが、さまざまな植物の根圏土壌中の微生物叢に基づいて構築されます。定量的PCR技術を用いて、各コミュニティの構成を明瞭に解読します。バイオフィルムのバイオマスは、それらの潜在的な代謝相互作用の強さを示しているが、協力の背後にあるさまざまな特性やメカニズムはここでは明らかにできなかった<sup class…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、中国国家自然科学基金会(42307173および42107328)および国家重点研究開発プログラム(2022YFD1500202および2022YFF1001800)によって財政的に支援されました。P.W.、Z.Xが研究を設計しました。P.W、B.X、Z.C、J.X、N.Zがデータを分析し、数値を作成しました。P.W.は原稿の初稿を書きました。Z.X.、R.Z.、Q.S.が原稿を改訂しました。
0.2 % Na4P2O7 solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 20041418 | Used to dilute the soil suspension. |
100 μm Nylon Cell Filter | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | F613463-0001 | Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm. |
2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | L03336903 | Used to sterilize the seeds. |
24-well Plate | Merck & Co., Inc. | PSRP010 | Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation. |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Bioolook Scientific Research Special | 2360010 | Used to prepare MSgg media. |
50 mL Centrifuge Tube | Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. | 62.547.254 | Properly-sized centrifuge tubes for our protocol. |
75% C2H5OH solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 801769680 | Used to sterilize the seeds. |
Acinetobacter baumannii XL-1 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
Bacillus velezensis SQR9 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
Bacteria DNA Kit | Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd. | D3350020000K04U021 | Used to extract bacterial DNA. |
Black Soil I | Nanjing Agricultural University | N/A | Black soil from Jilin Province. |
Black Soil II | Nanjing Agricultural University | N/A | Black soil from Heilongjiang Province. |
Burkholderia cenocepacia XL-2 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
CaCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10035048 | Used to prepare MSgg media. |
Centrifuge | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | G508009-0001 | High-speed centrifuge. |
ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech Co.,Ltd. | Q311-02 | Used for DNA amplification in qPCR. |
Clean Bench | Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. | NB026143 | Used for aseptic operation. |
Constant Temperature Incubator | ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd | GNP-9080BS-![]() |
Used for microbial cultivation. |
Cristal Violet Dye | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | A600331 | Used for pellicle biofilm staining and quantifivation. |
Cucumber Seed | Nanjing Agricultural University | N/A | "Jinchun I" cucumber seed. |
Culturome v 1.0 | The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification |
FeCl3 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011918 | Used to prepare MSgg media. |
Fridge | Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd. | BCD-556WKPM(Q) | Used for strain preservation. |
Glutamate | Bioolook Scientific Research Special | 2180020 | Used to prepare MSgg media. |
Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010618 | Used to prepare MSgg media. |
Hydroponic Planting Basket | Yulv Furniture Store | 6526262626 | Used for cucumber hydroponics. |
KH2PO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10017618 | Used to prepare MSgg media. |
MgCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 7791186 | Used to prepare MSgg media. |
MnCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10400101 | Used to prepare MSgg media. |
Msgg Medium | Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd. | BES20791KB | Pellicle biofilm culture medium. |
Na2HPO4·7H2O | Merck & Co., Inc. | S9390-100G | Used to prepare TSB media. |
NaCI | Chinasun Specialty Products co., Ltd. | HS0416 | Used to prepare TSB media. |
NaH2PO4·H2O | Merck & Co., Inc. | S9638-25G | Used to prepare TSB media. |
PBS-S Buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | E607008-0001 | Basic buffer for living tissues. |
Phenylalanine | RYON | RT3486L005 | Used to prepare MSgg media. |
Pipette | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | BS-1000-T | Used for strain inoculation. |
PMD19T Plasmid | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd. | D102A | Used to generate qPCR standard curves. |
Pot | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | YHHWS2401 | Used for cucumber soil culture. |
Primer for qPCR | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Used for DNA amplification in qPCR. |
Real-Time PCR Instrument | Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd. | 4484073 | Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm. |
Roary | The Wellcome Trust SangerInstitute | N/A | Used to design primers of qPCR |
Shaker | Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd | ZQTY-50S | Used for solution mixing and microbial cultivation. |
Silwet L-77 | Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd. | SL77080596 | Used to prepare TSB media. |
Soy peptone | Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd | HB8275 | Used to prepare TSB media. |
Spectrophotometer | Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd. | 76713100010 | Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation. |
Sterile Water | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | SW150302 | Used to wash the pellicle biofilm. |
Sterilized Nitrile Gloves | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | 223016852LLZA | Used for basic experimental operations. |
Template DNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Used for DNA amplification in qPCR. |
Thiamine | Bioolook Scientific Research Special | 2180020 | Used to prepare MSgg media. |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Used to prepare TSB media. |
Tryptophan | Bioolook Scientific Research Special | 2190020 | Used to prepare MSgg media. |
TSB Medium | Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd. | 024048 | Broad-spectrum bacterial medium. |
TSB-Msgg Meidium | Nanjing Agricultural University | N/A | Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability. |
ZnCl2 | Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd | C0310520123 | Used to prepare MSgg media. |