概要

根圏土壌からの多種バイオフィルム群集構築へのアプローチ

Published: May 24, 2024
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概要

ここでは、さまざまな根圏土壌から相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを確立するための迅速かつ標準化された手順を紹介します。これは、複雑な根圏土壌微生物叢を調査し、シミュレートするために設計された独自のプロトコルです。

Abstract

マルチスピーシーズバイオフィルムは、根圏土壌を含む自然界のバクテリアの自然発生的で支配的なライフスタイルですが、現在の理解は限られています。ここでは、相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを迅速に確立するためのアプローチを提供します。最初のステップは、示差遠心分離法を使用して根圏土壌から細胞を抽出することです。その後、これらの土壌細胞を培地に接種して、ペリクルバイオフィルムを形成します。インキュベーションの36時間後、バイオフィルムとその下の溶液の細菌組成を、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング法を使用して決定します。一方、ペリクルバイオフィルムからのハイスループット細菌分離は、限界希釈法を使用して行われます。次に、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングデータ(ペリクルバイオフィルムサンプル)で最も存在量の多い上位5つの細菌分類群を選択し、多種バイオフィルムコミュニティの構築にさらに使用します。5つの細菌分類群のすべての組み合わせは、24ウェルプレートを使用して迅速に確立され、クリスタルバイオレット染色アッセイによって最も強いバイオフィルム形成能力が選択され、qPCRによって定量されました。最後に、最も堅牢な合成細菌の多種バイオフィルムコミュニティを上記の方法で取得しました。この方法論は、根圏多種バイオフィルムの研究を行い、これらの種間の相互作用を支配する原理を研究するための代表的なコミュニティを特定するための有益なガイダンスを提供します。

Introduction

バイオフィルムは、表面に付着しているか、界面に結合している複雑な微生物群集を表しています。自然の生息地、臨床現場、産業環境など、さまざまな環境で遭遇する細菌の大部分は、バイオフィルムコミュニティ内で存続していることは広く認識されています1。土壌では、根の表面とそれに隣接する厚さ2 mmの領域を含む根圏は、栄養の利用可能性が高まった生態学的ニッチを形成します。特定の細菌は、このニッチを利用するための戦略を進化させ、微生物の増殖を促進し、根圏2でのバイオフィルムコミュニティの形成を促進しました。

根圏微生物は植物の「第2のゲノム」と考えられています3。植物生長促進微生物(PGPM)は、植物と共生し、生育促進と生物制御機能4を発現します。一方では、PGPMは植物の根に栄養素を供給し、栄養素の取り込みを促進し、病原体から防御し、根圏土壌の汚染物質を分解することができます5。一方、PGPMは、植物の根の滲出液を成長と進化の栄養源として利用し、それによって根圏の土壌と根系に独自の代謝を通じて影響を与えます。これらすべての機能の前提条件は、植物の根圏におけるPGPMの効果的なコロニー形成であり、安定したバイオフィルムを形成することであることは注目に値します6。

根圏バイオフィルムは根圏微生物の集合過程に影響を及ぼし、根圏微生物集合の時間的・空間的特性は多種バイオフィルムの相互作用と密接に関連している7。植物とマイクロバイオームの相互作用のハブとして機能し、植物が効果的に相互作用するための安定した制御可能なニッチを提供します。したがって、根圏バイオフィルムの研究は、植物と微生物の相互作用についての洞察を得るための重要な方向性でもあります。

しかし、現在、根圏の多種バイオフィルムに関する研究はほとんどありません。マイクロバイオームの構成は非常に複雑であるため、天然の微生物群集を取り巻く基本的な生態学的問題に答えることが難しくなっています8。実験の過程では、土壌の種類、植物の種類、多数の微生物群集など、多くの条件を考慮する必要があります。根圏マルチスピーシーズバイオフィルムの研究には、さまざまな要因が限界があります。

種間相乗相互作用や代謝物クロスフィーディング8など、根圏土壌からの多種バイオフィルムコミュニティをさらに調査するためには、実験室条件下で単純化された、代表的な、安定的で扱いやすい合成微生物コミュニティを人工的に構築することが望ましい9,10。ここでは、標準化されたプロトコルが、最新の微生物学的およびバイオインフォマティクス技術のいくつかを組み合わせています。

Protocol

このプロトコルは、一般に、さまざまな植物からの根圏土壌微生物叢に適用できます。ここでは、キュウリを例に挙げます。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。 1.細菌の分離 根圏土壌の分離キュウリの文化キュウリの種子を75%エタノールと2%次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)溶液で消毒し、滅?…

Representative Results

上記の手順に続いて、キュウリの根圏土壌微生物叢からのバイオフィルム形成能力の有意な勾配が観察されます(図1)。バイオフィルムアンプリコンシーケンシングにより、ペリクル中の種が確認されました(図2)。シーケンシングデータのヒートマッピングに基づいて、ペリクル内の存在量が残りの溶液中の細菌種よりも大きい上位5つの細菌種が選…

Discussion

プロトコルに従って、一連の堅牢な合成多種バイオフィルムコミュニティが、さまざまな植物の根圏土壌中の微生物叢に基づいて構築されます。定量的PCR技術を用いて、各コミュニティの構成を明瞭に解読します。バイオフィルムのバイオマスは、それらの潜在的な代謝相互作用の強さを示しているが、協力の背後にあるさまざまな特性やメカニズムはここでは明らかにできなかった<sup class…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学基金会(42307173および42107328)および国家重点研究開発プログラム(2022YFD1500202および2022YFF1001800)によって財政的に支援されました。P.W.、Z.Xが研究を設計しました。P.W、B.X、Z.C、J.X、N.Zがデータを分析し、数値を作成しました。P.W.は原稿の初稿を書きました。Z.X.、R.Z.、Q.S.が原稿を改訂しました。

Materials

0.2 % Na4P2O7 solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 20041418 Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. F613463-0001 Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. L03336903 Used to sterilize the seeds.
24-well Plate Merck & Co., Inc. PSRP010 Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) Bioolook Scientific Research Special 2360010 Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. 62.547.254 Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 801769680 Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd. D3350020000K04U021 Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I Nanjing Agricultural University N/A Black soil from Jilin Province.
Black Soil II Nanjing Agricultural University N/A Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10035048 Used to prepare MSgg media.
Centrifuge Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. G508009-0001 High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix Vazyme Biotech Co.,Ltd. Q311-02 Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. NB026143 Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd GNP-9080BS-Equation 1 Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. A600331 Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed Nanjing Agricultural University N/A "Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0 The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences N/A Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10011918 Used to prepare MSgg media.
Fridge Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd. BCD-556WKPM(Q) Used for strain preservation.
Glutamate Bioolook Scientific Research Special 2180020 Used to prepare MSgg media.
Glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010618 Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket Yulv Furniture Store 6526262626 Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10017618 Used to prepare MSgg media.
MgCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 7791186 Used to prepare MSgg media.
MnCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10400101 Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd. BES20791KB Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O Merck & Co., Inc. S9390-100G Used to prepare TSB media.
NaCI Chinasun Specialty Products co., Ltd. HS0416 Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O Merck & Co., Inc. S9638-25G Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. E607008-0001 Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine RYON RT3486L005 Used to prepare MSgg media.
Pipette Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. BS-1000-T Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd. D102A Used to generate qPCR standard curves.
Pot Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. YHHWS2401 Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. N/A Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd. 4484073 Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary The Wellcome Trust SangerInstitute N/A Used to design primers of qPCR
Shaker Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd ZQTY-50S Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77 Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd. SL77080596 Used to prepare TSB media.
Soy peptone Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd HB8275 Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd. 76713100010 Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. SW150302 Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. 223016852LLZA Used for basic experimental operations.
Template DNA Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. N/A Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine Bioolook Scientific Research Special 2180020 Used to prepare MSgg media.
Tryptone Thermo Fisher Scientific LP0042B Used to prepare TSB media.
Tryptophan Bioolook Scientific Research Special 2190020 Used to prepare MSgg media.
TSB Medium Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd. 024048 Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium Nanjing Agricultural University N/A Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2 Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd C0310520123 Used to prepare MSgg media.

参考文献

  1. Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).
  5. Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).
  6. Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).
  7. Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).
  8. Sun, X., et al. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. ISME J. 16, 774-787 (2021).
  9. Pandhal, J., Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).
  10. Grosskopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).
  11. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  12. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528, 364-369 (2015).
  13. Bakken, L. R. Separation and purification of bacteria from soil. Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).
  14. Yang, O., et al. Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions. Soil Biol Biochem. 155, 108178 (2021).
  15. Ren, D., et al. High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions. Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).
  16. Sun, X., et al. Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities. mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).
  17. Zhang, J., et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).
  18. Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation. ISME J. 9, 81-89 (2015).
  19. Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066 (2024).
  20. Palková, Z. Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature. EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).
  21. Xu, Z., et al. Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes. Curr Opin Microbiol. 72, 102269 (2023).

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記事を引用
Wang, P., Xia, B., Chen, Z., Xie, J., Sun, X., Tian, Q., Gao, C., Xun, W., Zhang, N., Zhang, R., Shen, Q., Xu, Z. An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil. J. Vis. Exp. (207), e66926, doi:10.3791/66926 (2024).

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