概要

原子間力顕微鏡を用いた剛性測定のためのマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離

Published: July 12, 2024
doi:

概要

私たちは最近、糖尿病に関連する網膜機能障害の新しいパラダイムとして網膜毛細血管硬化を特定しました。このプロトコルでは、網膜内皮培養物からマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスを単離する手順を詳しく説明し、続いて原子間力顕微鏡を用いた剛性測定技術について説明します。

Abstract

網膜毛細血管変性症は、糖尿病性網膜症 (DR) の初期段階の臨床的特徴です。私たちの最近の研究では、糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化が、炎症媒介性網膜毛細血管の変性において、これまで認識されていなかった重要な因果関係を果たしていることが明らかになりました。網膜毛細血管の硬直の増加は、内皮下マトリックスを架橋して硬化させる酵素であるリシルオキシダーゼの過剰発現に起因します。DRを早期に解決することで、DRの進行やそれに伴う視力低下の予防や遅延が期待されるため、内皮下マトリックスや毛細血管の硬直は、早期のDR管理に適切で新しい治療標的となります。さらに、網膜毛細血管の硬さを直接測定することは、動物およびヒトの被験者における網膜毛細血管の硬直を非侵襲的に評価するための新しいイメージング技術を開発するための重要な前臨床検証ステップとして役立ちます。この見解を念頭に置いて、ここでは、原子間力顕微鏡を使用したマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離および剛性測定のための詳細なプロトコルを提供します。

Introduction

網膜毛細血管は、網膜の恒常性と視覚機能を維持するために不可欠です。実際、初期の糖尿病における彼らの変性は、糖尿病患者の全個人のほぼ40%が罹患している微小血管疾患である糖尿病性網膜症(DR)の視力を脅かす合併症の発症に強く関与しています1。過去の研究では、糖尿病誘発性網膜血管炎症における異常な分子的および生化学的手がかりに重要な役割があることが実証されています2,3。しかし、最近の研究では、網膜毛細血管硬化が網膜血管の炎症と変性の決定要因でありながらこれまで認識されていなかった重要であると特定するDR病因の新しいパラダイムが導入されました4,5,6

具体的には、糖尿病による網膜毛細血管硬化の増加は、網膜内皮細胞(EC)におけるコラーゲン架橋酵素リシルオキシダーゼ(LOX)のアップレギュレーションによって引き起こされ、それが内皮下マトリックス(基底膜)を硬化させます4,5,6。マトリックスの硬化は、次に、その上にある網膜ECを硬化させ(機械的相互性による)、したがって、網膜毛細血管の剛性4の全体的な増加をもたらす。重要なことは、この糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化だけで、網膜ECの活性化と炎症媒介性EC死を促進することができるということです。この網膜EC欠損の機械的調節は、内皮メカノトランスダクションの変化、すなわち機械的な手がかりが生化学的シグナルに変換されて生物学的応答を生じさせるプロセスに起因する可能性がある7,8,9。重要なことに、ECの機械的手がかりの変化と内皮下マトリックス構造の変化は、早期の加齢性黄斑変性症(AMD)に関連する脈絡膜血管変性にも関与しており10,11,12、これは、変性網膜疾患における血管メカノバイオロジーのより広範な意味を証明しています。

特に、網膜毛細血管硬化は糖尿病の早期に起こり、これは網膜炎症の発症と一致します。したがって、網膜毛細血管の硬直の増加は、DRの治療標的および早期診断マーカーの両方として機能する可能性があります。この目的のためには、網膜毛細血管と内皮下マトリックスの信頼性の高い直接的な剛性測定を得ることが重要です。これは、細胞、細胞外マトリックス、および組織の剛性を直接測定するための、ユニークで高感度、正確、かつ信頼性の高い技術を提供する原子間力顕微鏡(AFM)を使用することによって達成することができる13。AFMは、サンプルに微小(ナノニュートンレベル)のインデンテーション力を加え、その剛性によってインデントAFMカンチレバーの曲がり具合が決まります。サンプルが硬いほど、カンチレバーは曲がり、その逆も同様です。私たちは、培養内皮細胞、内皮下マトリックス、および単離されたマウス網膜毛細血管4,5,6,11,12の剛性を測定するために、AFMを広く使用してきました。これらのAFM剛性測定は、DRおよびAMDの病因の主要な決定要因として内皮メカノバイオロジーを特定するのに役立ちました。視覚研究におけるメカノバイオロジーの範囲を広げるために、ここでは、単離されたマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの剛性測定にAFMを使用するためのステップバイステップのガイドを提供します。

Protocol

すべての動物処置は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に従って実施され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物およびケア委員会(IACUC;プロトコル番号ARC-2020-030)(OLAW機関動物福祉保証番号A3196-01)によって承認されました。以下のプロトコルは、体重が ~25 g (糖尿病マウス) および ~32 g (非糖尿病マウス;ジャクソン研究所)。…

Representative Results

マウス網膜毛細血管孤立した網膜毛細血管のAFM剛性測定には、その機構的完全性を損なう可能性のあるサンプルの取り扱い手順が含まれます。これを防ぎ、AFM測定の実現可能性、信頼性、再現性を確保するために、除核眼を5%ホルマリンに4°Cで一晩固定してから、血管を分離します。ホルマリン濃度の低下、固定温度の低下、固定時間の制限、角膜穿刺の欠如を伴うこの穏や?…

Discussion

AFMは、大動脈や動脈などの大きな血管の硬直の疾患関連の変化を測定するために広く使用されています16。これらの知見は、アテローム性動脈硬化症などの心血管合併症における内皮メカノバイオロジーの役割を確立するのに役立ちました17。これらの発見に基づいて、私たちは、早期のDRにおける網膜微小血管病変の発症における内皮メカノバイオロジー?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (K.G.へ)、Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (K.G.へ)、W.M. Keck Foundation から The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant (Doheny Eye Institute へ)、Ursula Mandel Fellowship and UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (I.S.T. へ) の支援を受けました。この研究は、Research to Prevent Blindness, Inc.からUCLAの眼科への無制限の助成金によっても支援されました。この記事の内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter Merck Millipore SLGVM33RS Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium Corning 20-031-CV Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate Falcon Corning 353043
15 mL centrifuge tube Corning 430791 Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe BD 302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette FisherBrand 13-678-20A
60×15 mm Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002
6-well plate Falcon Corning 353046
Aqua-Hold 2 Pap – 13 mL Pen Scientific Device Laboratory 9804-02
Blade holder X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10 Bard-Parker 371110
Dental Wax Electron Microscopy Sciences 50-949-027
Dissecting microscope Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10% Millipore Sigma HT501128-4L Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes – wiper tissue Kimtech Science 34133
Micro spatula Fine Science Tools 10089-11
Orbital Shaker Lab Genius SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer Ted Pella, Inc. 5667
Phase contrast microscope Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Labconco 302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL Eppendorf 22363352
Stereoscope AmScope SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide – White tab – Pre-cleaned – 25x75x1.0 mm FisherBrand 1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 – Biotechnology Grade VWR E553-500ML pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade VWR VWRV0458-25G 10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade Corning 46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS Corning 20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium Thermo Fisher Scientific 14040-117 pH 7.4
Ammonium hydroxide Sigma-Aldrich 338818
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A4034
Collagen IV antibody Novus Biologicals NBP1-26549
DNase I Qiagen 79254
Ethanolamine Sigma-Aldrich 398136
Fibronectin antibody Sigma-Aldrich F6140
Fluoromount Invitrogen-Thermo Fisher Scientific 00-4958-02
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Glass coverslips (12mm) Fisher 12-541-000
Glutaraldehyde Electron microscopy Sciences 16220
Human retinal endothelial cells (HREC) Cell Systems Corp ACBRI 181
MCDB131 medium Corning 15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC) Cell Biologics C57-6065
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific  BP151-100
Trypsin Gibco-Thermo Fisher Scientific 25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe Bruker SAA-SPH-1UM A 19 micron tall hemispherical probe with 1
micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe Bruker PFQNM-LC-V2 A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,
 Spring constant 0.1N/m
 camera XCAM family Toupcam 1080P HDMI
Desktop to run the camera Asus Asus desktop Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip Cellvis D29-14-1.5-N 29mm glass bottom dish with
 14 mm micro-well
Nanowizard 4 Bruker Nanowizard 4 Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope Zeiss Axiovert 200 Inverted microscope with 10X objective

参考文献

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記事を引用
Santiago Tierno, I., Agarwal, M., Matisioudis, N., Chandrakumar, S., Ghosh, K. Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (209), e66922, doi:10.3791/66922 (2024).

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