私たちは最近、糖尿病に関連する網膜機能障害の新しいパラダイムとして網膜毛細血管硬化を特定しました。このプロトコルでは、網膜内皮培養物からマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスを単離する手順を詳しく説明し、続いて原子間力顕微鏡を用いた剛性測定技術について説明します。
網膜毛細血管変性症は、糖尿病性網膜症 (DR) の初期段階の臨床的特徴です。私たちの最近の研究では、糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化が、炎症媒介性網膜毛細血管の変性において、これまで認識されていなかった重要な因果関係を果たしていることが明らかになりました。網膜毛細血管の硬直の増加は、内皮下マトリックスを架橋して硬化させる酵素であるリシルオキシダーゼの過剰発現に起因します。DRを早期に解決することで、DRの進行やそれに伴う視力低下の予防や遅延が期待されるため、内皮下マトリックスや毛細血管の硬直は、早期のDR管理に適切で新しい治療標的となります。さらに、網膜毛細血管の硬さを直接測定することは、動物およびヒトの被験者における網膜毛細血管の硬直を非侵襲的に評価するための新しいイメージング技術を開発するための重要な前臨床検証ステップとして役立ちます。この見解を念頭に置いて、ここでは、原子間力顕微鏡を使用したマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離および剛性測定のための詳細なプロトコルを提供します。
網膜毛細血管は、網膜の恒常性と視覚機能を維持するために不可欠です。実際、初期の糖尿病における彼らの変性は、糖尿病患者の全個人のほぼ40%が罹患している微小血管疾患である糖尿病性網膜症(DR)の視力を脅かす合併症の発症に強く関与しています1。過去の研究では、糖尿病誘発性網膜血管炎症における異常な分子的および生化学的手がかりに重要な役割があることが実証されています2,3。しかし、最近の研究では、網膜毛細血管硬化が網膜血管の炎症と変性の決定要因でありながらこれまで認識されていなかった重要であると特定するDR病因の新しいパラダイムが導入されました4,5,6。
具体的には、糖尿病による網膜毛細血管硬化の増加は、網膜内皮細胞(EC)におけるコラーゲン架橋酵素リシルオキシダーゼ(LOX)のアップレギュレーションによって引き起こされ、それが内皮下マトリックス(基底膜)を硬化させます4,5,6。マトリックスの硬化は、次に、その上にある網膜ECを硬化させ(機械的相互性による)、したがって、網膜毛細血管の剛性4の全体的な増加をもたらす。重要なことは、この糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化だけで、網膜ECの活性化と炎症媒介性EC死を促進することができるということです。この網膜EC欠損の機械的調節は、内皮メカノトランスダクションの変化、すなわち機械的な手がかりが生化学的シグナルに変換されて生物学的応答を生じさせるプロセスに起因する可能性がある7,8,9。重要なことに、ECの機械的手がかりの変化と内皮下マトリックス構造の変化は、早期の加齢性黄斑変性症(AMD)に関連する脈絡膜血管変性にも関与しており10,11,12、これは、変性網膜疾患における血管メカノバイオロジーのより広範な意味を証明しています。
特に、網膜毛細血管硬化は糖尿病の早期に起こり、これは網膜炎症の発症と一致します。したがって、網膜毛細血管の硬直の増加は、DRの治療標的および早期診断マーカーの両方として機能する可能性があります。この目的のためには、網膜毛細血管と内皮下マトリックスの信頼性の高い直接的な剛性測定を得ることが重要です。これは、細胞、細胞外マトリックス、および組織の剛性を直接測定するための、ユニークで高感度、正確、かつ信頼性の高い技術を提供する原子間力顕微鏡(AFM)を使用することによって達成することができる13。AFMは、サンプルに微小(ナノニュートンレベル)のインデンテーション力を加え、その剛性によってインデントAFMカンチレバーの曲がり具合が決まります。サンプルが硬いほど、カンチレバーは曲がり、その逆も同様です。私たちは、培養内皮細胞、内皮下マトリックス、および単離されたマウス網膜毛細血管4,5,6,11,12の剛性を測定するために、AFMを広く使用してきました。これらのAFM剛性測定は、DRおよびAMDの病因の主要な決定要因として内皮メカノバイオロジーを特定するのに役立ちました。視覚研究におけるメカノバイオロジーの範囲を広げるために、ここでは、単離されたマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの剛性測定にAFMを使用するためのステップバイステップのガイドを提供します。
AFMは、大動脈や動脈などの大きな血管の硬直の疾患関連の変化を測定するために広く使用されています16。これらの知見は、アテローム性動脈硬化症などの心血管合併症における内皮メカノバイオロジーの役割を確立するのに役立ちました17。これらの発見に基づいて、私たちは、早期のDRにおける網膜微小血管病変の発症における内皮メカノバイオロジー?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (K.G.へ)、Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (K.G.へ)、W.M. Keck Foundation から The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant (Doheny Eye Institute へ)、Ursula Mandel Fellowship and UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (I.S.T. へ) の支援を受けました。この研究は、Research to Prevent Blindness, Inc.からUCLAの眼科への無制限の助成金によっても支援されました。この記事の内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Retinal Capillary Isolation | |||
0.22 µm PVDF syringe filter | Merck Millipore | SLGVM33RS | Low Protein Binding Durapore |
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium | Corning | 20-031-CV | Final concentration 1X, pH 7.4 |
12-well plate | Falcon Corning | 353043 | |
15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic |
20 mL Luer-Lok TIP syringe | BD | 302830 | |
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | |
60×15 mm Tissue Culture Dish | Falcon Corning | 353002 | |
6-well plate | Falcon Corning | 353046 | |
Aqua-Hold 2 Pap – 13 mL Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
Blade holder | X-ACTO | ||
Carbon Steel Surgical Blade #10 | Bard-Parker | 371110 | |
Dental Wax | Electron Microscopy Sciences | 50-949-027 | |
Dissecting microscope | Am-scope | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Millipore Sigma | HT501128-4L | Final concentration 5% (v/v) |
Kimwipes – wiper tissue | Kimtech Science | 34133 | |
Micro spatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
Orbital Shaker | Lab Genius | SK-O180 | |
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm Tweezer | Ted Pella, Inc. | 5667 | |
Phase contrast microscope | Nikon TS2 | ||
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 302380001 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL | Eppendorf | 22363352 | |
Stereoscope | AmScope | SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X | |
Superfrost Plus microscopy slide – White tab – Pre-cleaned – 25x75x1.0 mm | FisherBrand | 1255015 | |
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 – Biotechnology Grade | VWR | E553-500ML | pH 8 for trypsin solution |
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade | VWR | VWRV0458-25G | 10 % (w/v) trypsin solution |
Water Molecular Biology Grade | Corning | 46-000-CM | |
Subendothelial Matrix | |||
10X PBS | Corning | 20-031-CV | |
1X PBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | pH 7.4 |
Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Collagen IV antibody | Novus Biologicals | NBP1-26549 | |
DNase I | Qiagen | 79254 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
Fibronectin antibody | Sigma-Aldrich | F6140 | |
Fluoromount | Invitrogen-Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Glass coverslips (12mm) | Fisher | 12-541-000 | |
Glutaraldehyde | Electron microscopy Sciences | 16220 | |
Human retinal endothelial cells (HREC) | Cell Systems Corp | ACBRI 181 | |
MCDB131 medium | Corning | 15-100-CV | |
Mouse retinal endothelial cells (mREC) | Cell Biologics | C57-6065 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-100 | |
Trypsin | Gibco-Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
AFM Measurement | |||
1 µm Probe | Bruker | SAA-SPH-1UM | A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m |
70 nm LC probe | Bruker | PFQNM-LC-V2 | A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius, Spring constant 0.1N/m |
camera | XCAM family | Toupcam | 1080P HDMI |
Desktop to run the camera | Asus | Asus desktop | Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM |
Dish holder for coverslip | Cellvis | D29-14-1.5-N | 29mm glass bottom dish with 14 mm micro-well |
Nanowizard 4 | Bruker | Nanowizard 4 | Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples |
Phase contrast micrscope | Zeiss | Axiovert 200 | Inverted microscope with 10X objective |