概要

単離された作業用ラット心臓モデルを使用して、ドナーの心臓保存戦略をテストする

Published: October 04, 2024
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概要

ドナーの心臓保存戦略をテストするための ex vivo で分離された作業ラット心臓プロトコルについて説明します。この論文では、げっ歯類のドナー心臓の静的冷蔵で使用するためのプロトコルについて説明します。しかしながら、このプロトコルは、循環器死および脳死後のドナー心臓にも使用することができる。

Abstract

ドナーの心臓保存ソリューションの最適化は、臓器の回収、輸送、移植中のドナー心臓の虚血再灌流障害を軽減する上で重要な役割を果たしてきました。私たちの研究室からの以前の研究では、ドナーの心臓保存溶液にトリニトリン酸グリセリルとエリスロポエチンを追加すると、長期の低温保存後および循環器死後の心臓の提供における心臓の機能回復が大幅に改善できることが示されました。この補充プロトコルは、オーストラリア、ベルギー、および英国周辺の移植ユニットで臨床使用に実施されています。ここでは、 ex vivo 単離されたワーキングラット心臓(IWRH)灌流回路を使用してサプリメント戦略をテストするためのプロトコルを概説します。この方法論を使用すると、サプリメント戦略は、長期の低温静的保存、脳死後の提供、および循環死後のドナーの心臓保存のコンテキストでテストできます。大動脈血流、冠状動脈血流、心拍出量、脈圧、および心拍数によって測定される心臓機能回復は、特定の保存戦略がドナー心臓の虚血再灌流損傷を最小化できるかどうかを判断できる。

Introduction

心臓移植の成功は、ドナーの心臓に用いられる保存方法に大きく左右されます。ドナーの心臓は、臓器の回収、輸送、および移植のプロセス全体を通じて虚血性損傷を受けます。ドナー臓器への虚血性損傷の程度は、適切なドナーの心臓保存戦略を選択することで軽減できます。冷静電保存(CSS)は、ドナーの心臓保存のための最も実現可能で一般的な方法であり続けています。ただし、CSSは必ずしもすべての心臓提供経路にとって最良の選択肢であるとは限りません。たとえば、循環死後 (DCD) 経路の提供によって調達された心臓は、常温機械灌流を使用して維持および生存率が評価されますが、脳死 (DBD) 経路後の提供によって調達された心臓は、CSS または低体温機械灌流を使用して保存できます。使用される保存戦略の別の重要な決定要因は、臓器の調達および輸送中に心臓が受ける温虚血(DCDの場合)または冷虚血(DBDの場合)の量です。

多くのセンターでは、虚血耐性を高め、移植後の心機能を改善するために、心臓保存液の追加薬理学的補給を使用しています。私たちの研究室のげっ歯類の研究では、エリスロポエチンと三硝酸グリセリルを心臓麻痺に補給すると、ドナー心臓の長期冷蔵保存後に心臓の機能回復が大幅に改善できることが示されました1,2。その後、これらの研究はドナーの心臓温存に関するブタ研究に進み、常温機灌流3,4,5を利用したDCD経路を介して調達された心臓の心臓麻痺溶液にエリスロポエチンとトリニトリン酸グリセリルを組み込むことにつながる前臨床の基礎を提供しました。現在、エリスロポエチンとトリニトリン酸グリセリルの補給は、CSS を組み込んだ臨床 DBD 心臓回復のためのオーストラリアの移植ユニットでも使用されています。以下に概説する単離されたワーキングラット心臓(IWRH)灌流プロトコルの全体的な目標は、実験室環境でドナーの心臓保存戦略をテストし、再灌流後にドナーの心臓機能を維持するための有効性をテストすることです。記載されている単離された作業ラット心臓プロトコルは、私たちの研究室内で20年以上にわたって使用されており、ドナーの心臓保存2,7,8,9を改善できる潜在的なサプリメントおよび/または戦略のスクリーニングに非常に有用であることが証明されています。

Protocol

すべての動物は、National Health and Medical Research Council(オーストラリア)のガイドラインに従って人道的なケアを受けました。すべての動物実験は、ガーバン医学研究所(オーストラリア、シドニー)の動物倫理委員会によって承認されました。 1. クレブス・ヘンセライト(KH)緩衝液の調製 2.36 M NaCl、0.094 M KCl、0.024 M MgSO4、0.02…

Representative Results

ベースライン灌流の結果により、初期実験 (事前保存) が成功したかどうかが決まります。ランゲンドルフモード中に表示される大動脈の流れは、14〜22 mL / minである必要があります。.ランゲンドルフフローは、大動脈の逆行性灌流により、流量計に負の値として表示されます。許容可能なランゲンドルフトレースの例を 図4Aに示します。 <p c…

Discussion

心臓のベースライン機能の敏感な性質を考えると、灌流装置を清潔で互換性のあるコンポーネントに保つように注意する必要があります。たとえば、正しいPVCチューブを使用する必要があります。シリコーンなどの一部のチューブ材料は、大動脈の流れと収縮性の低下に寄与する可能性がありますが、これはチューブを介した酸素の損失が原因である可能性がありま…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ここで紹介する研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(National Health and Medical Research Council Australia)、セントビンセントクリニック財団(St Vincent’s Clinic Foundation)、およびNSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant(ニューサウスウェールズ州健康心臓血管研究能力上級研究者助成金)からP.S.マクドナルドに授与された助成金によって資金提供されています。

Materials

1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box Bio Strategy Pty Ltd 0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500 Sigma-aldrich Pty Ltd CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit ADInstruments MLT1199 Data Acquisition
Bridge Amp ADInstruments FE221 Data Acquisition
Carbogen 555G2 BOC BOC002
Checktemp1 thermometer Hanna Instruments HI98509 Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12 Thomas Scientific 2848Y40 Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med. Thomas Scientific 8847T08 Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm. Thomas Scientific 8847T02 Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure Coherent Scientific 14121 Surgical Equipment
Closed Connector Thomas Scientific 8847E25 Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24 Specialist Medical Supplies S195 Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser Custom Blown Glassware Pty Ltd N/A Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir Custom Blown Glassware Pty Ltd N/A Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra Sigma-aldrich Pty Ltd G7528-1Kg To make Krebs Buffer
Dual Channel Console ADInstruments TS402 Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L 
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100 Bio-strategy Pty Ltd 1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD Coherent Scientific 14114 Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated Met-App Australia Pty Ltd 1352 Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts) Thermoline Scientific TU3 Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115 Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd 1258693 Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL Cenvet Australia Pty Ltd X5010 Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp Coherent Scientific  CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL Provet (NSW) Pty Ltd KETAI1 Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply Bio Strategy Pty Ltd MA048-500g To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter Thomas Scientific 8847V08 Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor John Morris 1015164 Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved Coherent Scientific WPI-501748 Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight Coherent Scientific WPI-501252 Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS John Morris 1014414 Mounting screws for pump heads
Open-sided connector Thomas Scientific 8847E05 Rig Construction
Paraformadehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g VWR Chemicals  26764.26 To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich Pty Ltd P5379-500g To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software ADInstruments ML826 Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF ADInstruments ME4PXN Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10 BSN Medical (Aust) Pty Ltd 73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK Merck Millipore SX0004701 Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK Merck Millipore XX1104707 Rig Construction
Single Buret Clamp Thomas Scientific 8847T32 Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler) Sigma-aldrich 59277 Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector Thomas Scientific 8847E35 Rig Construction
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Pty Ltd S6297 – 250g To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm Merck Millipore SX0004700 Rig Construction
syringes 1 mL box/100 Becton Dickinson Pty Ltd 302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm Met-App Australia Pty Ltd 1356 Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410 ADInstruments TS410 Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC Thermo Fisher NAL 8701-0600 Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC Thermo Fisher NAL 8701-0900 Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll Thermo Fisher NAL 8701-4120 Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades Coherent Scientific WPI-500-086 Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray Thermoline Scientific TLWB-30 Rig Construction

参考文献

  1. Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
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記事を引用
Villanueva, J. E., Gao, L., Dutta, S., Doyle, A., Joshi, Y., Macdonald, P. S. Using an Isolated Working Rat Heart Model to Test Donor Heart Preservation Strategies. J. Vis. Exp. (212), e66910, doi:10.3791/66910 (2024).

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