高分辨率荧光肺活测定法评估人免疫细胞中线粒体膜电位的动态变化

本文介绍的用于数据和方法开发的血液样本收集已获得华盛顿大学内部审查委员会的批准。代表性结果还包括从Jackson Laboratories购买的雄性C57BL / 6J小鼠（5-7个月大）的数据。所有动物程序均得到华盛顿大学动物福利办公室的批准。协议概述如图 1 所示。该协议的试剂制备可在 补充文件1中找到。 图 1：协议概述。 使用高分辨率荧光肺活量法评估新鲜人血液样本中分离的单核细胞 （CD14+） 和 T 细胞 （CD3+） 中线粒体膜电位的变化的工作流程。简称：TMRM，四甲基罗丹明甲酯;SUIT， 底物-解偶联剂-抑制剂滴定;ADP， 二磷酸腺苷;挖，洋地黄皂苷;Mal， 苹果酸;Pyr， 丙酮酸;过剩，谷氨酸;D1-10，连续10次ADP滴定。 请点击这里查看此图的较大版本. 1. 从全血中分离出血沉棕黄层 注：细胞分离修改自 Kramer 等人 27。 让 RPMI、密度梯度和离心机达到室温。在开始之前对生物安全柜和材料进行消毒。 将静脉血收集到三个 10 mL K2EDTA 管中。将管子倒置至少 3 次。 以500× g 离心管10分钟（22°C，9加速度[acc]，2减速[dec]）。 从每个试管中取出1mL血浆，并储存在-80°C以备将来分析。 将血浆和每根管的一半红细胞层转移到单个 50 mL 锥形管中。将 RPMI 加入至 40 mL 标记。倒置至少 3 次。 缓慢地将 10 mL 血浆溶液分层到四个 15 mL 锥形管中，其中包含 3 mL 的密度梯度。 以700× g 离心30分钟（22°C，5acc，2dec）。 收集所有血浆和含有外周单核细胞 （PBMC） 的血沉棕黄层，而不破坏红细胞。 以500× g 离心10分钟（22°C，5acc，5dec）并吸出上清液。 通过将PBMC沉淀重悬于10mL RPMI中并以500× g 离心10分钟（22°C，5acc，5dec）洗涤PBMC沉淀1x-2x。 2. CD14+和CD3+细胞的磁性分离 将一根柱子放在磁性细胞分离器的磁场中（参见 材料表）。用 3 mL RP-5 洗涤色谱柱。 将 PBMC 沉淀重悬于 80 μL RP-5 和 20 μL 抗 CD14 微珠中（参见 材料表）。在4°C孵育15分钟。 用 1 mL RP-5 重悬细胞，并将悬浮液加载到色谱柱上。收集流经标有“流通 1”的 15 mL 锥形管的未标记细胞。等到所有细胞悬液都通过色谱柱，然后继续用 3 mL RP-5 3x 洗涤，收集所有流出物。 小心地将色谱柱从磁场中取出，并将其放在新的 15 mL 锥形管上。加入 5 mL RP-5，并立即使用柱塞将色谱柱内容物吹入标有“CD14+”的收集管中。 将“流通1”以500× g 离心10分钟（22°C，5acc，5dec）并吸出上清液。 使用 流通 1 中的细胞，使用抗 CD3 微珠（参见 材料表）重复步骤 2.2-2.5 以分离 T 细胞。 将含有T细胞（CD3 +）和单核细胞（CD14 +）的管以300× g 离心5分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于 1 mL RP-5 中。 使用血细胞计数器或自动细胞计数仪确定细胞浓度。注：可以通过向血细胞计数器中加入 10 μL 1：10 或 1：20 的细胞稀释液来计数细胞。可以参考以前发表的使用血细胞计数器36对细胞进行计数的方案。 将 250 万个单核细胞或 500 万个 T 细胞移液到新的离心管中。以 2000 x g 离心 30 秒，吸出上清液并将细胞重悬于 MiR05 中，总体积为 20 μL，终浓度为 1.25 亿个单核细胞或 2.5 亿个 T 细胞/mL。注：选择最终浓度注射 250 万个单核细胞或 500 万个 T 细胞，体积为 20 μL。 从脾脏分离的小鼠 T 细胞也已使用该方法进行了测试。该过程可在 补充文件 1 中找到。 3. 高分辨率荧光肺活计 – 氧气和 TMRM 荧光校准 注：该方法改编自 Pharaoh 等人 11 之前对透化纤维所做的工作。TMRM 的高非抑制浓度用于淬灭模式，其中基体中 mMP 和 TMRM 浓度的关系是倒置的。因此，mMP 的降低导致 TMRM 染料从基质中释放并增加荧光32。 根据制造商的说明在 O.5K 呼吸计中安装 2 mL 腔室（参见 材料表）。打开仪器，将其连接到制造商提供的软件进行数据采集。 将温度调节至 37 °C，搅拌速度至 750 rpm。 用蒸馏水清洗腔室 3 次。用 0.54 mL Mir05 置水，完全关闭塞子，并使用集成抽吸系统 （ISS） 去除多余的缓冲液。抬起塞子，使室内氧气与使用塞子垫片平衡腔室氧气。 一旦氧通量稳定，就按照制造商的说明执行空气氧校准 （R1）。注意：氧通量可能需要 >30 分钟才能稳定下来。氧传感器需要使用连二亚硫酸盐滴定法测定 50-200 μM 的零点氧 （R0） 和背景氧通量。具体方法可以在制造商的手册中找到。 通过关闭塞子来密封腔室。注：与使用透化纤维的实验不同，这些腔室不需要对 PBMC 进行过度氧化。 R1 校准后密封腔室可为实验提供足够的氧气。氧水平应保持在50-250μM之间。如果氧气浓度低于阈值，则腔室可以部分打开，以便腔室氧气可以与室内空气中的氧气平衡。 TMRM 校准使用绿色 LED 荧光传感器（例如 525 nm）和 AmR 滤光片组（参见 材料表）。将荧光计 增益 设置为 1000 ，将 强度 设置为 1000。打开荧光传感器并开始记录基线。 注入 2.5 μL 0.05 mM TMRM，并在下一次 2.5 μL 进样之前让信号稳定（~2 分钟），直到总共进行 4 次进样，总 TMRM 浓度为 1 μM TMRM 在腔室中。使用汉密尔顿注射器进行所有注射。 通过为每次进样选择代表 0、0.25、0.5、0.75 和 1.0 μM TMRM 的荧光信号（电压）来校准荧光传感器，以进行五点校准。 4. 底物-解偶联剂-抑制剂滴定 （SUIT） 方案 注：运行空白实验，将 20 μL Mir05 注射到腔室中，而不是 20 μL 细胞悬液，因为 TMRM 信号将响应单独注射而变化（在代表性结果中讨论）。在下次进样之前，让氧通量信号稳定（约2-3分钟），用于空白和样品实验。以下滴定方案和预期观察结果见 表1。 一旦氧通量稳定，选择并标记氧通量和TMRM信号“前池”。 在 ~20 μL 中注射含有 500 万个 T 细胞或 250 万个单核细胞的细胞悬液并测量约 10 分钟。选择氧通量和 TMRM 信号并将其标记为“单元”。 通过注射 2 μL 1 mg/mL 洋地黄皂苷（终浓度：4 μg/mL）透化细胞。等待 20 分钟。选择氧通量和 TMRM 信号并将其标记为“Dig”。注意：建议在单独的实验中优化洋地黄皂苷浓度。 加入 2.5 μL 1 M 琥珀酸酯（终浓度：5 mM）。选择氧通量和 TMRM 信号并将其标记为“SUCC”。 一旦氧通量稳定，加入 5 μL 100 mM 苹果酸（终浓度：1.0 mM）、5 μL 1 M 谷氨酸（终浓度：10 mM）和 5 μL 500 mM 丙酮酸（终浓度：5 mM）。选择氧通量和 TMRM 信号并将其标记为“MPG”。 一旦氧通量稳定，滴定 ADP。选择每次滴定的速率，并根据滴定次数按顺序将其标记为“D”1 到 10。使用 表2中的滴定方案。 一旦氧通量稳定，执行一系列 1 μL 滴定 0.25 mM 羰基氰对（三氟甲氧基）苯腙 （FCCP），直至荧光信号达到最大值。选择并标记代表最小膜电位的氧通量和 TMRM 信号，并将其标记为“FCCP”。注意：通常需要 0.5-1.0 μM 的 FCCP 浓度来耗尽线粒体膜电位。注意：FCCP是有毒的。请参阅安全数据表 （SDS） 以进行正确处理。 可选：一旦氧通量稳定，注射 1 μL 0.25 mM 鱼藤酮以抑制复合物 I 并通过复合物 II 确定呼吸能力。注意：使用解偶联仪滴定后，膜电位的变化不再相关。注意：鱼藤酮是有毒的。请参阅 SDS 以正确处理。 一旦氧通量稳定，注射 1 μL 1.25 mM（终浓度：2.5 μM）抗霉素 A 以抑制线粒体呼吸。注意：抗霉素 A 有毒。请参阅 SDS 以正确处理。 5. 线粒体膜电位的计算和分析 使用空白实验，在注入空白样品（“预样品”）之前和每次进样之前记录校准的 TMRM 值（微摩尔 TMRM）。请参阅 图 2。 对于每个空白实验，通过将“预采样”TMRM浓度设置为1.0来计算背景比。计算 TMRM 的后续比例减少。计算所有空白实验的平均背景比。注意：要包含的空白实验数量可能取决于仪器的精度。参见 表 3 中来自五个不同空白实验的计算示例，其中每次滴定的平均背景比标准偏差介于 0 和 0.016 之间。 背景计算： 通过将样品实验的“样本前”TMRM 乘以每次进样的平均背景比来计算每个样品实验的背景。请参阅 表 3 中的计算示例。 背景校正：将实验的背景减去样品的测得的 TMRM 值。请参阅 表 4 中的计算示例。 FCCP 校正：从每次进样中减去 FCCP 背景校正的 mMP。请参阅 表 4 中的计算示例。 ADP 灵敏度曲线：通过使用在整个 ADP 滴定过程中收集的 mMP 值，将最高和最低膜电位分别设置为 100% 和 0%，归一化 ADP 驱动的 mMP 降低。使用首选的统计软件将数据拟合到非线性拟合回归模型中，以计算 ADP 在 mMP 上的半最大抑制浓度 （IC50）。注意：该曲线拟合 Prism 中的 [抑制器] 与归一化响应 – 可变斜率。 图 2：通过 TMRM 荧光计算线粒体膜电位 （mMP） 和 ADP 灵敏度。 通过高分辨率荧光肺活测定法对一个 T 细胞样本 （n = 1） 测量 TMRM 荧光来计算线粒体膜电位 （mMP） 和 ADP 敏感性的步骤。第 1 步：在空白样品中测量 TMRM 荧光，就像在生物样品中所做的那样。第 2 步：确定每次滴定时 TMRM 信号相对于每个空白实验样品之前的信号的比率。计算所有空白实验的每次滴定的平均值。第 3 步：通过将“样品前”荧光乘以每次滴定的平均背景比来计算每个样品实验的背景。第 4 步：计算每次滴定的背景和样品 TMRM 荧光之间的差异，以将数据表示为 mMP 或线粒体 TMRM 摄取。第 5 步：校正 mMP，以便与 FCCP 的完全解耦反映零 mMP。第 6 步：执行非线性回归，绘制 mMP 随 ADP 浓度增加而变化的图表。在 0.5 mL 腔室中进行测量，其中一个腔室含有来自健康志愿者的 500 万个 T 细胞。平均数据表示为SEM±平均值。单次重复的单个数据点表示时不带误差线。 请点击这里查看此图的较大版本.