このプロトコルは、成体のSprague Dawleyラットから摘出された後根神経節(DRG)をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し、培養する技術を提供します。
疼痛の最も一般的な末梢神経細胞の特徴は、刺激閾値の低下または後根神経節(DRG)からの末端神経の過敏症です。この過敏症の原因として提案されているのは、末梢組織の免疫細胞とニューロンとの相互作用に関連しています。 In vitro モデルは、これらのメカニズムが侵害受容器過敏症を引き起こす方法を理解するための基礎知識を提供してきました。しかし、 in vitro モデルは、有効性をヒトに翻訳するという課題に直面しています。この課題に対処するために、生理学的および解剖学的に関連する in vitro モデルが開発され、48ウェルプレートの3つの隔離されたコンパートメントで無傷の後根神経節(DRG)を培養しました。一次DRGは、人道的安楽死後に成体のSprague Dawleyラットから採取されます。余分な神経根をトリミングし、DRGを培養に適したサイズにカットします。その後、DRGは天然のハイドロゲルで増殖し、すべてのコンパートメントでしっかりとした増殖を可能にします。このマルチコンパートメントシステムは、神経突起からのDRG細胞体の解剖学的に関連性のある単離、生理学的に関連する細胞タイプ、および神経細胞と免疫細胞の間の相互作用を研究するための機械的特性を提供します。したがって、この培養プラットフォームは、治療の分離戦略を調査するための貴重なツールを提供し、最終的には疼痛を予測するためのスクリーニングアプローチの改善につながります。
慢性疼痛は、世界的に障害と失業の主な原因です1。慢性疼痛は、世界の成人の約20%が罹患しており、社会的および経済的に大きな負担を強いており2、米国では毎年5,600億ドルから6,350億ドルの総費用が見積もられています3。
慢性疼痛患者が示す主な末梢の特徴は、神経の刺激閾値の低下であり、これにより神経系が刺激に対してより敏感になります4,5。刺激の閾値が低下すると、以前は痛みを伴わなかった刺激に対する痛みを伴う反応(異痛症)や、痛みを伴う刺激に対する反応の増加(痛覚過敏)が生じる可能性があります6。現在の慢性疼痛治療薬の有効性は限られており、動物モデルで成功した治療法は、疼痛発現のメカニズムの違いにより、ヒトでの試験で失敗することがよくあります7。末梢感作メカニズムをより正確に模倣できるin vitroモデルは、新しい治療法の翻訳を増加させる可能性を秘めています8,9。さらに、培養システムにおける感作神経の重要な側面をモデル化することにより、研究者は閾値の低下を引き起こすメカニズムについてより深い理解を深め、それらを逆転させる新しい治療標的を特定することができます10。
理想的な in vitro プラットフォームまたは微生物学的システムは、遠位神経突起と後根神経節(DRG)細胞体の物理的分離、三次元(3D)細胞環境、 およびin vivo 条件を厳密に模倣する天然支持細胞の存在を組み込むことです。しかし、Caparasoらによる最近の論文11 では、現在のDRG培養プラットフォームにはこれらの主要な特徴が1つ以上欠けており、 in vivo 条件の再現には不十分であることが示されています。これらのプラットフォームは簡単にセットアップできますが、末梢感作の生物学的基盤を模倣していないため、 in vivo での有効性に変換されない可能性があります。この制限に対処するために、神経突起およびDRG細胞体の時間的流体分離を可能にするために、3つの隔離されたコンパートメントを有するヒドロゲルマトリックス内の後根神経節(DRG)の培養のために、生理学的に関連性のある in vitro モデルが開発された11。このモデルは、生理学的および解剖学的関連性の両方を提供し、 in vitroでニューロンの末梢感作を研究する可能性があります。
3D培養におけるDRG外植片の使用に対する関心の高まりは、DRG生存率の間接的な指標として機能する堅牢な神経突起成長を促進する能力によるものです12。初代新生児または胚性DRG外植片は、主に現在のin vitro培養プラットフォーム13,14で使用されていますが、成体げっ歯類からの外植片を使用すると、成熟したニューロン生理学のより良いモデルが提供され、新生児または胚性げっ歯類15からの外植片と比較して、ヒトのDRG生理学に密接に模倣されます。外植片DRGとは、主に天然の非ニューロン支持細胞を維持することにより、天然のDRG組織の細胞および分子組織の保存を指します。ここでは、このプロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRG外植片をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫および培養する方法を説明します(図1)。
頸椎、胸椎、腰椎からのDRGの培養では、神経突起の成長に観察可能な違いが見られず、有効性が示されています。このアプリケーションの目的は、デバイスの外側のコンパートメントに神経突起の成長を引き出すことでした。したがって、この記事ではDRGレベルを区別しませんでした。ただし、特定の実験に必要な場合は、実験者のニーズに合わせてDRGレベルを調整できます。現在、DRGの3D培養16には他のコンパートメント化された培養モデルがありますが、これらのデバイスには保存された天然の非ニューロン支持細胞が含まれていないため、翻訳が制限される可能性があります。採取したDRGの天然構造を維持することは、非ニューロン支持細胞の保持を確実にするため、重要です。これは、DRGニューロンとの相互作用がこれらのニューロンの機能特性を維持するために不可欠であるためです。いくつかの研究では、ニューロンの髄鞘形成を促進するために、解離したDRGをシュワン細胞などの非天然ニューロン細胞と共培養しました17,18,19。
このプロトコルは、成虫のSprague Dawley DRGを収穫し、それらを3D天然ハイドロゲルで培養する方法を概説しています。この方法とは対照的に、マウスやラットからDRGを採取する他のアプローチでは、脊柱を分離します。切除された脊柱は半分になり、脊髄はDRGs23,24,25を露出させるために取り除かれます。脊髄の損傷は血液供?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、NSF Grant (2152065) と NSF CAREER Award (1846857) の支援を受けました。著者は、このプロトコルに貢献してくれたWachs Labの現在および過去のメンバー全員に感謝します。 図1 の図はBiorenderで作成されています。
#5 forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | For trimming and cutting DRG |
10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
1x PBS (autoclaved) | Prepared in lab | 7.3 – 7.5 pH | |
24 well plates | VWR | 82050-892 | To temporarily store harvested and cut DRGs |
3 mL Syringe sterile, single use | BD | 309657 | |
48 well plates | Greiner Bio-One | 677180 | |
60 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | To hold media for trimming and cutting |
Aluminium foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | For DRG media |
Collagen type I | Ibidi | 50205 | |
Curved cup Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | For dissection |
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | For dissection |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | For DRG media |
Form cure | Form Labs | curing agent | |
Form wash | Form Labs | To wash excess resins off MC | |
Glass bead sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
Glass vials (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | For DRG media |
HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
High temp V2 resin | FormLabs | FLHTAM02 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | MilliporeSigma | 53747 | Used to make MAHA |
Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
Laminin | R&D Systems | 344600501 | |
Large blunt-nose scissors | Militex | EG5-26 | For dissection |
Large forceps (serrated tips) | Militex | 9538797 | For dissection |
Large sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | For dissection |
Low Retention pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-017 | For pipetting collagen and MAHA |
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA) | Prepared in lab | N/A | 85 – 115 % methacrylation |
Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 556-NG-100 | For DRG media |
Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | For DRG media |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) | EMD Millipore | 516106 | For DRG media |
pH test strips | VWR International | BDH35309.606 | |
Pipette tips (1000 µL) | USA Scientific | 1111-2021 | |
Preform 3.23.1 software | Formslab | To upload STL file | |
Rat | Charles River | ||
Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
Small sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | For dissection |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S6014 | |
Straight cup rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | For dissection |
Straight edge spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | For dissection |
Surgical Scaplel blade (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
Syring filters, PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
Tiny spring scissors | World Precision Instruments | 14003 | For trimming and cutting DRG |
UV lamp | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 – 18 mW/cm2) |